水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵基因?qū)Φ土酌{迫的響應(yīng)和叢枝菌根的影響.pdf

1、磷(P)是植物生長發(fā)育最為重要的生命元素之一，廣泛參與植物體內(nèi)的生化合成、能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝過程。由于化學(xué)和微生物的強(qiáng)烈固定，大多數(shù)自然土壤中的有效磷很低，限制著植物的生長發(fā)育。植物為了適應(yīng)低磷脅迫已經(jīng)進(jìn)化出了包括改變根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、與土壤中的菌根(Mycorrhiza)真菌形成共生體系、誘導(dǎo)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PT)的表達(dá)、改善根際土壤化學(xué)性質(zhì)等形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上的響應(yīng)機(jī)制。然而，植物能夠吸收磷素最重要的是實(shí)現(xiàn)根系細(xì)胞內(nèi)磷的跨膜運(yùn)

2、輸。植物根系吸收磷需要從質(zhì)外體運(yùn)輸?shù)焦操|(zhì)體，這是一個(gè)從低磷到高磷的跨膜運(yùn)輸過程。運(yùn)輸過程中磷與2-4個(gè)質(zhì)子通過共轉(zhuǎn)運(yùn)的模式進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pH值的降低需要質(zhì)膜H+-ATPase將過多的H+泵到細(xì)胞外以保持細(xì)胞間的pH平衡。由此形成的電勢差為P素的吸收提供了驅(qū)動(dòng)力。水稻作為一種模式作物，是我國最重要的糧食作物，因此開展水稻根系H+-ATPase基因功能研究及其與磷營養(yǎng)的響應(yīng)機(jī)制研究，對揭示植物高效調(diào)控吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷營養(yǎng)的機(jī)理以及培育磷

3、素高效吸收利用水稻品種具有重要意義。
　　 本研究以模式品種日本晴(Oryza sativa cv.Nipponbare L.)，水稻質(zhì)膜質(zhì)子泵基因OsA8完全敲除的純合突變體osa8(Tos17插入突變)及其野生型植株(Oryze Sativa ssp。Japonica cv.Hitomebore)為材料，通過RT-PCR、轉(zhuǎn)基因等方法研究了水稻根系質(zhì)膜H+-ATPase對磷脅迫及菌根調(diào)控的響應(yīng)機(jī)制和部分H+-ATPase基因

4、的功能。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過測定不同供磷水平下水稻根系質(zhì)膜質(zhì)子泵的活性結(jié)果顯示，磷脅迫水稻根系質(zhì)子泵的泵活性高于本身的水解活性，Vmax增加，Km降低。說明是由于質(zhì)膜H+-ATPase編碼的基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的增強(qiáng)，酶蛋白(翻譯水平)增強(qiáng)的綜合影響，亦或是翻譯后水平的調(diào)控。磷脅迫時(shí)水稻根系的質(zhì)膜H+-ATPase活性升高，可能對其根系分泌有機(jī)陰離子有一定的作用，以此來活化土壤中的難溶性磷，提高植物對磷的吸收。

5、r>　　 2.通過生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析討論了水稻質(zhì)膜H+-ATPase家族中各個(gè)基因的特點(diǎn)：水稻H+-ATPase家族基因分布在五個(gè)亞家族中(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，同家族基因同源性達(dá)到80％以上。通過構(gòu)建啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合的表達(dá)載體，檢測了OsA2、OsA3、OsA4、OsA7和OsA8基因的時(shí)空表達(dá)特征.GUS染色發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下OsA2、OsA3、OsA4和OsA7在根尖、側(cè)根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部位以及葉片中

6、均有表達(dá)，而OsA8基因在這些部位中均不表達(dá)或表達(dá)很弱。RT-PCR的結(jié)果顯示，屬于質(zhì)膜H+-ATPase家族基因Ⅰ和Ⅱ兩個(gè)亞家族的OsA2、OsA3和OsA7基因在植株根系和地上部有較強(qiáng)烈的表達(dá)，與GUS染色結(jié)果相一致。而沒有表達(dá)或表達(dá)極低的OsA8基因可能在特定的部位，或特殊的條件或時(shí)間下表達(dá)。
　　 3.OsA8啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因水稻侵染試驗(yàn)結(jié)果顯示，OsA8基因在菌根水稻根系的叢枝部位不表達(dá)。
　　

7、 4.Osa8突變體及其野生型水稻低磷條件下接種菌根菌(G.intraradices)的砂培試驗(yàn)結(jié)果表明，菌根誘導(dǎo)水稻質(zhì)子泵基因OsA8在根系中的增強(qiáng)表達(dá)高達(dá)105倍。而同家族的OsA1、OsA2、OsA3、OsA7和OsA9則在根系中出現(xiàn)了顯著的下調(diào)趨勢。與野生型水稻相比，OsA8基因的突變導(dǎo)致了水稻菌根真菌的侵染效率降低了約20％，并且水稻根系中磷濃度的升高、地上部磷濃度的降低。這可能是由于OsA8基因的缺失，降低了水稻中磷素從根系

8、向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，使得根系中磷素積累濃度相對較高。從而直接導(dǎo)致了水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pht1家族基因中除OsPT8外的很多成員在根系中表達(dá)量的降低。
　　 5.OsA8基因超表達(dá)水稻對磷營養(yǎng)的響應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，OsA8基因超表達(dá)提高了水稻質(zhì)膜H+-ATPase的活性。在低磷脅迫條件下，OsA8基因超表達(dá)顯著提高了水稻對磷的吸收速率以及植株體內(nèi)磷素從根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。這與osa8突變體中降低了磷素從根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果相

9、一致。這種改變伴隨著水稻H+-ATPase基因和水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)的變化。超表達(dá)OsA8基因下調(diào)了OsA1、OsA3和OsA9基因在葉片中的表達(dá)量。對Pht1家族而言，除了與低磷誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的關(guān)鍵基因OsPT2和OsPT6有著密切的關(guān)系以外，超表達(dá)OsA8基因同時(shí)也下調(diào)了同家族的OsPT1、OsPT3、OsPT4和OsPT9的表達(dá)。
　　 總之，通過對敲除質(zhì)膜質(zhì)子泵基因的突變體和超表達(dá)突變體的分析，

10、我們發(fā)現(xiàn)低磷脅迫時(shí)，質(zhì)膜質(zhì)子泵OsA8基因通過影響根系質(zhì)膜質(zhì)子泵的活性，改變了水稻對菌根菌的侵染和磷素的吸收能力，又因下調(diào)部分水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)而影響了水稻植株體內(nèi)根系和地上部磷的分布情況，進(jìn)而反饋調(diào)控了Pht1家族其他基因的表達(dá)特征。由此，OsA8基因在響應(yīng)低磷脅迫和菌根菌侵染時(shí)表現(xiàn)出來的對磷素吸收和磷素從根系向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)速率的重要作用，有望應(yīng)用于通過轉(zhuǎn)基因手段培育適應(yīng)低磷條件生長和促進(jìn)菌根形成的磷素高效利用的水稻新品