BLG調(diào)控區(qū)指導(dǎo)hLF基因在GMECs、SP2-0和雜交瘤細(xì)胞中表達(dá)的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)利用電轉(zhuǎn)染法將含有人乳鐵蛋白基因的表達(dá)載體，導(dǎo)入到山羊乳腺上皮細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞中，經(jīng)G418及PCR篩選獲得陽性細(xì)胞；轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖后經(jīng)催乳素誘導(dǎo)，培養(yǎng)液上清通過ELISA檢測證明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)并分泌出入乳鐵蛋白。 利用細(xì)胞融合技術(shù)將未轉(zhuǎn)染人乳鐵蛋白基因的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與表達(dá)人乳鐵蛋白的ICR小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過HAT篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞增殖后經(jīng)催乳素誘導(dǎo)，培養(yǎng)液上清通過ELISA檢測。同樣獲得了表達(dá)人乳鐵蛋

2、白的陽性雜交瘤細(xì)胞株。 1、BLG調(diào)控序列與人乳鐵蛋白功能基因構(gòu)建表達(dá)載體 表達(dá)載體的組成：山羊β-乳球蛋白基因調(diào)控序列，包括4.2kb的5'端和1.8kb的3'端，人乳鐵蛋白(hLF) cDNA，人巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子序列及SV40polyA序列和新霉素抗性篩選基因(Neor)等基因元件 2、奶山羊乳腺上皮細(xì)胞系的建立 從泌乳奶山羊的乳腺實(shí)質(zhì)組織中分離得到原代乳腺上皮細(xì)胞，由于原代上皮細(xì)胞中含成纖

3、維樣細(xì)胞混合生長，所以傳代時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用分步胰酶消化反復(fù)貼壁法在DMEM/F12培養(yǎng)液中經(jīng)2～3次的選擇傳代可獲得純的乳腺上皮細(xì)胞系。 3、表達(dá)人乳鐵蛋白的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞株和SP2/0細(xì)胞株的建立 通過電轉(zhuǎn)染法將含有Neor標(biāo)記基因的BLC-14載體基因片段導(dǎo)入奶山羊乳腺上皮細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞中，經(jīng)G418(400μg/ml)抗性篩選培養(yǎng)兩周左右，獲得59株抗G418的單克隆乳腺上皮細(xì)胞株和44株抗G418的單克隆小

4、鼠骨髓瘤陽性細(xì)胞株。對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的抗性細(xì)胞株進(jìn)行催乳素誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)24h后的細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果顯示有8株G418抗性乳腺上皮細(xì)胞株能夠表達(dá)重組人乳鐵蛋白，乳腺上皮細(xì)胞的平均表達(dá)水平是0.781μg/mL，以及12株表達(dá)人乳鐵蛋白的小鼠骨髓瘤的陽性細(xì)胞株，小鼠骨髓瘤細(xì)胞的平均表達(dá)水平是0.435μg/mL。 4、表達(dá)人乳鐵蛋白的雜交瘤陽性細(xì)胞株的建立 通過未轉(zhuǎn)染人乳鐵蛋白基因的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與表達(dá)人乳鐵蛋白

5、的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞融合，經(jīng)過HAT篩選獲得54株整合有人乳鐵蛋白基因的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)過蛋白質(zhì)表達(dá)檢測共有6株穩(wěn)定表達(dá)的陽性雜交瘤細(xì)胞株，陽性雜交瘤細(xì)胞株平均表達(dá)水平是0.653μg/mL。 結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的BLC14載體既能夠在山羊乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)，同樣在非特異性宿主細(xì)胞—小鼠骨髓瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞中也能夠表達(dá)的結(jié)果，可以推測出BLG調(diào)控序列與人乳鐵蛋白功能基因構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓瘤細(xì)胞后，可以對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)