桃葉型半夏多倍體誘導(dǎo)研究.pdf

1、三葉半夏(Pinelli.ternat.(Thunb Breit.)為天南星科半夏屬植物，其用藥史已有2000余年，是我國(guó)最常用的傳統(tǒng)中藥材之一。三葉半夏以無(wú)性繁殖為主，其自然繁殖系數(shù)低。由于社會(huì)需求的迅猛增長(zhǎng)和生態(tài)環(huán)境的日漸退化，三葉半夏野生資源急劇減少，供需矛盾日益加劇。為探尋新的資源補(bǔ)償途徑，本研究以植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)為手段，開(kāi)展半夏多倍體誘導(dǎo)研究，以期獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的多倍體半夏。其主要結(jié)果概述如下：
　　 1.半夏懸浮培

2、養(yǎng)體系的建立
　　 (1)疏松愈傷組織的誘導(dǎo)以葉片為外植體，通過(guò)激素篩選，優(yōu)化了培養(yǎng)基配方。研究結(jié)果表明：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)M1)：MS+NA.0.0.mg/L+6-BA1 mg/L；繼代培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)M2)：MS+2，4-.1 mg/L+6-B.0 mg/L+K.0.5mg/L，繼代培養(yǎng)2～3次即可獲得疏松的愈傷組織。
　　 (2)通過(guò)對(duì)半夏懸浮培養(yǎng)條件的研究，確定了懸浮培養(yǎng)的條件：MS+2，4-.1.5mg/L+

3、6-B.0 mg/L+K.0 mg/L，愈傷組織接種量6％～8％(m/v)，p.5.8，轉(zhuǎn)速為10.rpm。繼代培養(yǎng)周期為.d時(shí)，細(xì)胞的密度和存活率達(dá)到最高，分別為6.53×105個(gè)/ml和42.94％。
　　 2.半夏單細(xì)胞的多倍體誘導(dǎo)及其再生
　　 (1)通過(guò)對(duì)半夏單細(xì)胞再生培養(yǎng)條件的研究，確定了單細(xì)胞再生培養(yǎng)的條件：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)的起始密度為8×105個(gè)/ml，培養(yǎng)方式為液體淺層培養(yǎng)或固液雙層培養(yǎng)，單細(xì)胞培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)M

4、3). MS+NA.0 mg/L+6-B.1 mg/L+C.20.mg/L，轉(zhuǎn)接的細(xì)胞團(tuán)大小為直徑2～.mm。愈傷組織培養(yǎng)基：MS+NA.0.0.mg/L+6-BA1 mg/L，生根培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)M4):1/.MS.IB.0 mg/L.NA.0.1mg/L+糖4％+活性炭0.25％。
　　 (2)用單細(xì)胞進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)時(shí)，秋水仙堿處理濃度為0.001％，0.003％，0.005％，0.007％，0.009％和0.01％，秋水仙堿處

5、理時(shí)間為1.h，2.h，4.h和7.h。誘導(dǎo)結(jié)果顯示：秋水仙堿濃度為0.001％，0.003％和0.005％時(shí)，均獲得了變異植株，其中以0.003％秋水仙堿處理單細(xì)胞2.h的誘導(dǎo)效果最好，其誘導(dǎo)率為35.59％。
　　 3.變異植株的倍性鑒定
　　 (1)根尖染色體鑒定表明，由秋水仙堿誘導(dǎo)獲得的變異植株為十六倍體，其染色體數(shù)為2n=16x=208；對(duì)照植株為八倍體，其染色體數(shù)為2n-8x=104。
　　 (2)染

6、色體加倍后，再生的多倍體植株在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上面都存在顯著差異。通過(guò)再生組培苗的栽培實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多倍體植株矮化、葉片顏色加深、葉片厚度增加、葉柄粗壯，塊莖增大；通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，多倍體植株葉片表皮氣孔密度減小、氣孔增大、氣孔中的葉綠體數(shù)目增多；通過(guò)葉綠素含量分析發(fā)現(xiàn)多倍體植株的葉綠素含量明顯增加。
　　 本研究通過(guò)秋水仙堿處理桃葉型半夏單細(xì)胞成功獲得了十六倍體半夏植株。我們建立了一種新的半夏多倍體誘導(dǎo)方法，同時(shí)也說(shuō)明單細(xì)胞是進(jìn)行半