菜青蟲酚氧化酶原編碼基因的分子克隆及其表達研究.pdf

1、酚氧化酶(phenoloxidase，EC.1.14.18.1，簡稱PO)是一種重要的酶類，廣泛存在于無脊椎動物、脊椎動物、植物、細菌和真菌等生物體內(nèi)，在昆蟲變態(tài)發(fā)育和免疫系統(tǒng)中起著重要作用，主要功能可總結(jié)為：
　　 (1)參與表皮的硬化和黑化；
　　 (2)對卵殼的鞣化作用；
　　 (3)參與傷害防御；
　　 (4)加速傷口的愈合等，是一種潛在的靶標酶。
　　 本文通過RT-PCR和RACE技術

2、，克隆得到了編碼菜青蟲(Pieris rapae)酚氧化酶原的兩個基因Prophenoloxidase－1(PrPPO1)和Prophenoloxidase-2(PrPPO2)，并對序列信息進行了分析；并通過Semi-Quantitative RT-PCR和Quantitative Real－time PCR研究了PPO1和PPO2在菜青蟲不同發(fā)育時期的表達情況；并用白僵菌制劑注射菜青蟲5齡幼蟲，研究白僵菌分生孢子對菜青蟲PPO轉(zhuǎn)錄活性

3、的影響，同時使用兩種典型的PO抑制劑--槲皮素和曲酸，對菜青蟲5齡幼蟲進行了處理，測定了處理后4h、8h和12h時PPO1的表達情況。研究結(jié)果如下：
　　 1.PrPPO1全長cDNA序列有3338bp，包含一個2049bp的開放閱讀框(ORF)，一個63bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和一個1226bp的帶有加尾信號的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。開放閱讀框從第64個核苷酸開始，終止于第2102個核苷酸，由其推導的氨基酸序列以甲

4、硫氨酸為起始氨基酸，長為682個氨基酸，分子量為78.57kDa，估測等電點pI為6.37。
　　 2.PrPPO2部分cDNA序列有1679bp，包含一個1173bp的開放閱讀框(ORF)和一個506bp的帶有加尾信號的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。開放閱讀框從第1個核苷酸開始，終止于第1173個核苷酸，由于該片段為部分cDNA，其他相關參數(shù)不做預測。
　　 3.PrPPO1基因的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲PPO1基因具

5、有較高的同源性(69.73％～73.15％)；PrPPO2基因的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲PPO2基因具有較高的同源性(70.0％～72.0％)。
　　 4.PrPPO1和PrPPO2各均具有兩個高度保守的銅離子結(jié)合位點，及位于銅離子結(jié)合位點內(nèi)的6個保守的組氨酸殘基，此外，PrPPO1還包含一個類似于脊椎動物的α-巨球蛋白的硫羥酸酯區(qū)域。PrPPO1與PrPPO2的N端均不含信號肽，不存在跨膜結(jié)構域。
　　 5.PrPP

6、O1中，α-螺旋占17.16％，隨機卷曲63.20％，它們是PrPPO1最大量的結(jié)構元件，延伸鏈占19.65％，散布在整個蛋白質(zhì)中，無β轉(zhuǎn)角存在，同源建模顯示PrPPO1三級結(jié)構均為“α/β型”中的“滾筒結(jié)構”。
　　 6.PrPPO1在成蟲中的表達量設定為1.0,PrPPO1在卵和4齡幼蟲中表達量最高，表達量分別為2.76和5.60；PrPPO1在5齡幼蟲和蛹中表達量較低，為0.21和0.26；在1齡、2齡、3齡幼蟲中，PrP

7、PO1的表達量比較接近，分別為2.16、1.82和1.52。PrPPO2在成蟲中的表達量設定為1.0,PrPPO2在4齡幼蟲中表達量最高，表達量為13.24；卵和3齡幼蟲次之；PrPPO2在5齡幼蟲中表達量較低，為0.96；在1齡和2齡幼蟲中，PrPPO1的表達量比較接近，分別為2.98和2.65；預蛹和蛹比較接近，分別為1.91和1.42。通過Real-timePCR和RT-PCR比較PrPPO表達量變化結(jié)果非常相近。