扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及其在物種鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、扇貝作為重要的經(jīng)濟(jì)貝類，其養(yǎng)殖業(yè)被迅速的開展起來(lái)，逐漸成為我國(guó)重要的增養(yǎng)殖貝類，而飛速發(fā)展的分子標(biāo)記輔助育種體系為優(yōu)良品種的快速培育提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。微衛(wèi)星標(biāo)記作為一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)，加之其自身的優(yōu)點(diǎn)，在扇貝遺傳分析上的應(yīng)用也日益得到重視。本研究以四種扇貝(櫛孔扇貝、海灣扇貝、華貴櫛孔扇貝和蝦夷扇貝)為研究材料，篩選了四種扇貝的微衛(wèi)星標(biāo)記并對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在扇貝肌肉柱和幼蟲鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行了探討。 1.櫛孔扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記

2、的篩選 搜索NCBI dbGSS數(shù)據(jù)庫(kù)，得到櫛孔扇貝序列3648條。用軟件“Repeat Reporter Version1.5”查找得到核心序列為三堿基、四堿基的微衛(wèi)星序列。經(jīng)序列比對(duì)和引物設(shè)計(jì)、優(yōu)化以及多態(tài)性檢測(cè)后，共篩選得到24個(gè)具有多態(tài)性的標(biāo)記，等位形式在2-9之間，平均等位形式數(shù)目為5.1。Ho和He的范圍各自為0.000-0.7500和0.1866-0.8495，各位點(diǎn)之間沒(méi)有明顯的連鎖不平衡現(xiàn)象，經(jīng)Markov c

3、hain test檢驗(yàn)24個(gè)位點(diǎn)中有12個(gè)偏離Hardy-Weinberg平衡。 2.海灣扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選 搜索NCBI dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中所有櫛孔扇貝的EST序列7060條，并用軟件搜索了所有可能的核心序列為兩堿基、三堿基、四堿基、五堿基及六堿基的微衛(wèi)星序列，結(jié)果193條序列符合嚴(yán)謹(jǐn)度，占整個(gè)ESTs庫(kù)的2.73％。其中：兩堿基重復(fù)含量>三堿基重復(fù)>五堿基重復(fù)>四堿基重復(fù)>六堿基重復(fù)。兩堿基重復(fù)的微衛(wèi)星含量最高的是

4、(AT)n，其次是(AG)n，再次之為(AC)n。最后篩選得到20個(gè)多態(tài)性引物，共擴(kuò)增得到92個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增得到的等位基因個(gè)數(shù)為2-11個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出4.6個(gè)等位形式。觀測(cè)到的雜合度和期望雜合度范圍分別為0.0667-0.8000和0.0961-0.8253。 3.華貴櫛孔扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選 以華貴櫛孔扇貝為材料，基因組DNA經(jīng)Rsa I進(jìn)行酶切，經(jīng)過(guò)膜富集(AC)n和(AG)n后構(gòu)建了華貴櫛孔扇貝微

5、衛(wèi)星富集文庫(kù)。運(yùn)用菌落原位雜交的方法，使用(AC)n和(AG)n為探針經(jīng)過(guò)雜交后，篩選得到陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序共獲得了60個(gè)華貴櫛孔扇貝的微衛(wèi)星序列，設(shè)計(jì)的22對(duì)引物中，10對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，等位基因數(shù)目從3到6個(gè)不等，平均等位形式數(shù)目為4.2，觀測(cè)雜合度和期望雜合度從0-0.88和0.29-O.76。 4.蝦夷扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選 同上用富集文庫(kù)的方法(HaeIII)篩選蝦夷扇貝的微衛(wèi)星標(biāo)記，篩選得到的12個(gè)多態(tài)

6、性位點(diǎn)中，擴(kuò)增得到的等位基圍從2個(gè)到8個(gè)不等，平均每個(gè)位點(diǎn)得到4.5個(gè)等位基因。觀測(cè)到的雜合度范圍為0-0.8333，期望雜合度范圍為0.2546～0.8231。以上表明，這些微衛(wèi)星標(biāo)記都具有較高的多態(tài)性，均具有較高的信息含量，適合進(jìn)行各種遺傳學(xué)分析。 5.物種特異性微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及靈敏度檢測(cè) 本研究共采用了72個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行物種特異性標(biāo)記的確認(rèn)。最后選取了8個(gè)在任何溫度下只能在目的物種中擴(kuò)增得到DNA片段的標(biāo)記作為

7、鑒定用標(biāo)記。用幼蟲進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，結(jié)果顯示各標(biāo)記的檢測(cè)靈敏度非常高：為2％和1％，該標(biāo)記系統(tǒng)為扇貝的物種鑒定以及生態(tài)學(xué)調(diào)查提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 6.扇貝肌肉柱及幼蟲鑒定本研究 利用以上8個(gè)標(biāo)記組成的鑒定系統(tǒng)對(duì)三種產(chǎn)品(冷凍、干品和罐頭)的7批樣品進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，6批次的樣品分別是單一物種組成的。其中編號(hào)為DM3的樣品經(jīng)過(guò)WAVE檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，此批樣品是櫛孔扇貝和海灣扇貝的混合物。單個(gè)模板擴(kuò)增的PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示其中4個(gè)

8、樣品是櫛孔扇貝，16個(gè)樣品為海灣扇貝，因此，我們可以基本確定此批樣品中櫛孔扇貝和海灣扇貝的所占的百分比分別為20％4和80％。實(shí)驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到華貴櫛孔扇貝樣品。 對(duì)于雜交幼蟲的鑒定，結(jié)果顯示：所有從養(yǎng)殖場(chǎng)取得的10批樣品全部在某一物種處出現(xiàn)條帶或者檢測(cè)蜂，說(shuō)明樣品中的雜樣應(yīng)該低于1％(靈敏度)。反復(fù)取樣的結(jié)果顯示所有的幼蟲都是由單一物種組成的。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取了4批大池幼蟲，從中任意挑選至少72個(gè)個(gè)體進(jìn)行單一幼蟲模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯