茶多酚氧化酶基因的克隆及其工程菌的構(gòu)建.pdf

1、茶黃素作為一種茶葉所特有的色素物質(zhì)，由于其具有極強(qiáng)的抗氧化及清除自由基的功能，近些年來受到研究者的廣泛關(guān)注，并在保健和抗癌治癌等領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)，是目前茶葉深度開發(fā)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)成分，在天然藥物、功能食品、日用化工、功能飲料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。茶黃素的合成機(jī)理是兒茶素在茶多酚氧化酶(PPO)的催化作用下氧化聚合形成鄰醌，鄰醌進(jìn)一步縮合形成茶黃素。目前茶黃素的生產(chǎn)技術(shù)主要為體外酶促氧化的方法，其中多酚氧化酶是催化反應(yīng)合成茶黃素的關(guān)鍵

2、酶，如何得到大量、優(yōu)質(zhì)的酶源成為提高茶黃素生產(chǎn)技術(shù)的關(guān)鍵因素。
　　 本文旨在通過基因工程的手段，利用融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建出茶PPO的基因表達(dá)載體，并進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)入優(yōu)勢表達(dá)菌中，以期構(gòu)建出茶PPO基因工程菌，并對其進(jìn)行應(yīng)用基礎(chǔ)研究，從而解決茶黃素生產(chǎn)的關(guān)鍵酶源問題，進(jìn)而為茶黃素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 通過對各種CTAB法的綜合與優(yōu)化成功提取并純化得到了純度較高的迎霜茶樹基因組

3、DNA，并通過PCR擴(kuò)增得到PPO的編碼區(qū)片段。通過測序可知，迎霜茶樹的PPO編碼區(qū)序列長度為1800bp。并將其登錄于GenBank，注冊號為GQ214317。
　　 對PPO的核酸序列以及翻譯得到的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：所得到的迎霜品種茶樹PPO基因與其他茶樹基因都高度同源，相似性達(dá)到99％以上；PPO基因共編碼599個氨基酸，分子式為C3008H4677N813O900S18，分子量為67207.2，理論

4、等電點(diǎn)為6.24。PPO同屬于酪氨酸酶、PPO1_DML和PPO1_KFDV三個超家族，且PPO的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域Cu2+結(jié)合區(qū)具有高度的保守性；且PPO沒有跨膜區(qū)，不存在信號肽，其存在于葉綠體的可能性最大，很有可能具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
　　 將克隆得到的PPO基因重組到pET-28a表達(dá)載體上，構(gòu)建出原核表達(dá)載體pET-PPO，并將其轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)，實(shí)現(xiàn)了PPO的原核誘導(dǎo)表達(dá)。原核表達(dá)過程中，目的蛋白容易形成包涵體

5、，酶的活性較低；SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，在71KD處有一條特異蛋白條帶，與預(yù)測大小相符。
　　 將克隆得到的PPO基因重組到pPICZαA融合蛋白表達(dá)載體上，構(gòu)建出茶PPO的融合蛋白真核表達(dá)載體pPICZα-PPO2，并將其轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中，成功篩選出多個陽性轉(zhuǎn)化子。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，采用Western-Blotting方法在培養(yǎng)液中成功檢測到誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白。酶

6、活檢測結(jié)果也顯示誘導(dǎo)產(chǎn)物具有較高的相對酶活性，能夠正確發(fā)揮酶蛋白的生物功能。
　　 對PPO的真核蛋白表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化策略研究，首先對PPO基因進(jìn)行改造，構(gòu)建出茶PPO的融合蛋白真核表達(dá)載體pPICZα-PPO3和pPICZα-PPO4。然后將pPICZα-PPO2、pPICZα-PPO3和pPICZα-PPO4分別轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115、KM71和SMD1168三種酵母菌種中，得到9種PPO的重組轉(zhuǎn)化子，同時篩選出相應(yīng)的陽性