利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與番茄RIN互作蛋白的初步研究.pdf

1、果實的發(fā)育成熟過程是植物所特有的生命現(xiàn)象,而果實本身也在人類的飲食結構和營養(yǎng)供給中占有舉足輕重的地位。因此,這個特殊的生長發(fā)育過程一直都倍受關注。近年來,隨著分子和遺傳學在果實乙烯合成、乙烯響應和轉錄因子調(diào)控等方面研究的不斷深入,人們果對實發(fā)育,尤其是鮮果的成熟機制有了更深層次的認識。
　　 番茄(Solanum lycopersicum)存在有大量與果實成熟相關的突變體,所以一直被認為是果實發(fā)育成熟研究的模式植物。作為眾多突變

2、體的典型,rin突變存于乙烯調(diào)控途徑的上游,并且不受乙烯調(diào)控。最近,人們通過圖位克隆的方法在rin基因位點克隆到了MADS-box類轉錄因子RIN,隨即又在草莓這種研究非呼吸躍變成熟途徑的模式植物中發(fā)現(xiàn)了其同源基因。由此推測RIN可能是兩種不同成熟途徑的果實中共存的保守調(diào)控因子。本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng),篩選與RIN互作的相關蛋白,進行功能分析。不僅可以更好的了解RIN這類轉錄因子在復雜的成熟調(diào)控網(wǎng)絡中的作用機制,更可以讓其在延長貨架和

3、提高果實品質中得到廣泛的應用。研究結果如下:
　　 1.依據(jù)GenBank上的RIN基因信息以及生物信息學分析,通過RT-PCR的方法分別獲得了全長及亞克隆片段RIN(MIK、IKC、IK和K)。
　　 2.構建了基因完整片段和亞克隆片段的pGBKT7釣餌表達載體,進行自激活和毒性檢測后發(fā)現(xiàn),各重組釣餌載體均無自激活性,但pGBKT7-RIN和pGBKT7-IKC則對宿主菌Y187有明顯的毒性抑制現(xiàn)象。
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4、.通過半定量RT-PCR的方法對PIN基因在番茄AC(Ailsa Craig)幼果、綠熟、破色、粉紅和紅熟發(fā)育時期果實mRNA水平的表達差異進行分析。結果顯示RIN基因在幼果期基本不表達,從綠熟期開始隨著果實成熟度的增加表達也隨之增加,在紅熟期達到最大。
　　 4.以破色、粉紅和紅熟時期果實的mRNA的混合樣品為模板,成功分離、純化了果實成熟期混合的雙鏈cDNA,將其與pGADT7-Rec線性載體共轉化酵母宿主菌AH109后,構

5、建了酵母雙雜交文庫。對文庫進行插入片段大小檢測,發(fā)現(xiàn)片段在500bp到3kb之間,且多態(tài)性良好。血球計數(shù)法檢測文庫滴度為1.2×109cells/ml。
　　 5.用pGBKT7-MIK重組質粒作為釣餌對文庫進行mating,得到了約200個雜交菌斑,結合效率為1.2％。PCR檢測后隨機選取40個片段進行測序。
　　 6.測序得到了31個序列的部分信息,對序列信息在SGN Uni基因數(shù)據(jù)庫進行序列比對后,得到了14個有效