犬貓結(jié)核病分子檢測(cè)技術(shù)的建立及防治方法的初步探索.pdf

1、揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文犬貓結(jié)核病分子檢測(cè)技術(shù)的建立及防治方法的初步探索姓名：王偉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：丁鏟秦愛建20090501II揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文從上海市不同區(qū)縣采集352份犬貓鼻液、痰液、尿液及寵物飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，以16srRNA、IS6110、Rv3878、ISl081、ESAT6和CFP10等為目的基因設(shè)計(jì)引物，結(jié)果顯示：非健康犬貓樣品DNA中，ESAT6和CFP10基因檢出率分別為43％和386％，對(duì)

2、應(yīng)的16srI斟A基因符合率僅為7％～8％，而致病性分枝桿菌特異的引物：TB274、IS6110和ISl081基因不能被檢出；而在健康犬貓樣品DNA中，所有基因的檢出率均很低。本研究結(jié)果表明，健康犬貓可能攜帶有大量非典型分枝桿菌，而且罹病犬貓被非典型分枝桿菌感染的幾率較健康犬貓更大。3CFP10／ESA工6融合蛋白誘導(dǎo)IFN吖產(chǎn)生的初步研究以牛分枝桿菌強(qiáng)毒株DNA為模板，擴(kuò)增獲得CFP10和ESAB6基因，利用疏水性氨基酸(Gly4Se

3、r)3為Linker，將兩個(gè)蛋白融合表達(dá)于pET32a()載體中，并再ESAT6的C端連接HIVTat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，得到的兩種融合蛋白表達(dá)載體分別命名為：pCEl06、pCET。將上述載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得CET和CEl06可溶性融合蛋白，將其分別免疫小鼠制備多抗，經(jīng)重組桿狀病毒檢測(cè)為免疫熒光陽性反應(yīng)。將上述抗原免疫Km系小鼠，4免后，取脾臟，分離淋巴細(xì)胞，利用CFP10(118齟)、ESAB6(116姐)多

4、肽為刺激物，采用ELISPOT法檢測(cè)IFN吖分泌水平。結(jié)果顯示：上述融合蛋白并可誘導(dǎo)低劑量的IFN吖產(chǎn)生，但差異并不顯著。4結(jié)核桿菌泛酸激酶的原核表達(dá)及純化泛酸激酶(CoaA)是泛酸(CoA)合成的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶，可以用擬膽堿藥物通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制泛酸激酶的活性從而達(dá)到抑菌目的。本試驗(yàn)克隆表達(dá)了牛分枝桿菌和鳥分枝桿菌的泛酸激酶基因(co以)，將其連接到pET32a()載體中進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果顯示：鳥分枝桿菌泛酸激酶呈現(xiàn)可溶性表達(dá)，而牛型分枝桿