苜蓿中華根瘤菌Cu-Zn抗性機(jī)制及其促進(jìn)天藍(lán)苜蓿對重金屬的吸收作用.pdf

1、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)CCNWSX0020是從陜西風(fēng)縣尾礦區(qū)生長的天藍(lán)苜蓿根瘤內(nèi)分離出來的一株菌，不僅具有多種重金屬抗性，還能促進(jìn)天藍(lán)苜蓿在Cu污染土壤中生長。這種雙重特性使得該共生體系成為重金屬污染土壤修復(fù)的有效工具。本文通過RNA-Seq、基因敲除等技術(shù)分析了S.meliloti CCNWSX0020的Cu/Zn抗性機(jī)制，并對Cu/Zn抗性因子在根瘤菌-豆科植物共生體系及其生物修復(fù)Cu/Zn污

2、染土壤中的作用進(jìn)行了研究。
　　通過轉(zhuǎn)錄組分析揭示了S.meliloti CCNWSX0020在四種脅迫條件下的基因表達(dá)模式。首先不考慮不同重金屬處理間的基因表達(dá)模式的差異，由短期的(30min)重金屬誘導(dǎo)表達(dá)的基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于長期的(24h)重金屬處理，表明多數(shù)早期即時響應(yīng)的基因應(yīng)對重金屬脅迫時發(fā)揮了第一道防線作用，而少數(shù)長期表達(dá)的基因必然在S.meliloti CCNWSX0020重金屬抗性機(jī)制中發(fā)揮重要作用。在Cu或Zn長期

3、脅迫下，編碼P1B-typeATPase、多銅氧化酶、外膜蛋白和金屬結(jié)合蛋白的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，說明S.meliloti CCNWSX0020可能通過外排、氧化或隔離等機(jī)制來解毒。此外，通過分析不同的重金屬脅迫對基因表達(dá)模式的影響，發(fā)現(xiàn)Zn誘導(dǎo)下54％的表達(dá)上調(diào)的基因也受Cu共同誘導(dǎo)，其主要集中在離子轉(zhuǎn)運、能量產(chǎn)生、氧化還原反應(yīng)、碳水化合物和氨基酸代謝等過程，說明S.meliloti CCNWSX0020通過多種途徑來防御非特異性的金

4、屬損傷，或調(diào)整整個細(xì)胞的代謝水平來適應(yīng)外界的環(huán)境脅迫。除了共同響應(yīng)Cu和Zn誘導(dǎo)的基因外，還有一些金屬特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)運蛋白、分子伴侶等被Cu或Zn誘導(dǎo)表達(dá)，說明S.meliloti CCNWSX0020對細(xì)胞內(nèi)Cu/Zn的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)是復(fù)雜精細(xì)的，且對Cu/Zn的解毒或抗性機(jī)制有所不同。
　　P1B-type ATPases是細(xì)菌中非常重要的金屬離子外排系統(tǒng)。S.meliloti CCNWSX0020中存在五個P1B-typ

5、e ATPase，通過基因敲除和功能互補(bǔ)實驗證實其中CopA1b和ZntA兩個P1B-type ATPase與Zn/Cd/Pb抗性相關(guān)。根據(jù)序列同源性分析，CopA1b屬于P1B-1ATPases，而ZntA屬于P1B-2ATPases。S.meliloti CCNWSX0020中zntA基因的表達(dá)受Zn2+/Cd2+/Pb2+誘導(dǎo)，且zntA基因缺失后造成細(xì)胞對Zn/Cd/Pb高度敏感，菌體內(nèi)大量Zn/Cd/Pb積累，說明S.meli

6、loti CCNWSX0020中的ZntA是一個典型的Zn2+-ATPase，參與細(xì)胞內(nèi)Zn2+/Cd2+/Pb2+的外排。而S meliloti CCNWSX0020中copA1b基因的表達(dá)受Cu+/Ag+誘導(dǎo)，但copA1b基因缺失后不影響細(xì)胞的Cu耐受性，反而對高濃度的Zn/Cd/Pb敏感，造成菌體內(nèi)Zn/Cd/Pb積累，說明S.meliloti CCNWSX0020中的CopA1b雖然屬于P1B-1ATPases，但也可能參與細(xì)

7、胞內(nèi)的Zn2+/Cd2+/Pb2+的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。
　　通過基因缺失突變驗證了S.meliloti CCNWSX0020中六個Cu/Zn脅迫下表達(dá)顯著上調(diào)的基因與Cu/Zn抗性相關(guān)。金屬敏感性檢測顯示，△cueO對Cu專一敏感，其他幾個突變體則對Cu/Zn/Cd/Pb不同程度敏感，說明CueO發(fā)揮專一性地抗Cu作用，而其他幾個基因與S.meliloti CCNWSX0020的Cu/Zn/Cd/Pb耐受性有關(guān)。同時，選取S.melilo

8、ti CCNWSX0020野生型、Cu敏感突變體△cueO和三個Cu/Zn敏感突變體（△cusA-tike，△yedYZ，△fixH-like），來研究重金屬抗性因子對生物修復(fù)的作用。結(jié)果顯示，無論在有無重金屬脅迫條件下，△cusA-like突變菌株幾乎喪失了與天藍(lán)苜蓿共生的能力;cueO基因缺失嚴(yán)重抑制了Cu脅迫條件下△cueO突變菌株與天藍(lán)苜蓿的侵染和結(jié)瘤過程;在Cu和Zn脅迫條件下，yedYZ或xH-like基因缺失降低了△yed