肉毒梭狀芽孢桿菌課題講稿

1、肉毒桿菌與肉毒素專題,小組成員： 周業(yè)豐 王露 劉超 劉雨佳 周婷 何帥 王晶晶 田晶 陳星 余 潔 周芬 喻靖,2013年8月3日，新西蘭最大乳品公司恒天然集團(tuán)發(fā)布消息，稱該公司一個(gè)工廠2012年5月生產(chǎn)的濃縮乳清蛋白檢出肉毒桿菌，可能受污染的產(chǎn)

2、品用于嬰兒奶粉、兒童成長奶粉和運(yùn)動(dòng)飲料的生產(chǎn)。新西蘭當(dāng)局宣佈全球召回1000噸可能遭到污染的乳制品。,目錄,,,1 基本介紹,2 毒害及中毒機(jī)理,3 檢測,本文目錄結(jié)構(gòu),4 應(yīng)用及展望,1896 年 Vahermengen 從臘腸中毒研究中，首先分離出肉毒梭菌 并證實(shí)它能在厭氧環(huán)境中生長 且可產(chǎn)生外毒素—— 肉毒毒素1910年獲悉肉毒毒素在抗原性上有所不同, 按免疫學(xué)上的差異可分為 A B C D E F G 等7 個(gè)型別,

3、因而將肉毒梭菌也分為對(duì)應(yīng)的 7 個(gè)型,發(fā)展史,,肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌屬 ,具有該菌的基本特性: 厭氧、桿狀、形成芽孢 、G+ , 肉毒毒素 。,培養(yǎng)特性：在蛋黃培養(yǎng)基上菌落周圍出現(xiàn)混濁圈 。,概況,廣泛分布于土壤、淤泥、動(dòng)物糞便等，其中土壤為重要污染源，它可借助食品、農(nóng)產(chǎn)物、禽類、海產(chǎn)品、水果等傳播到各地,最適pH：6.6-8.2， 當(dāng)pH9.0，不能繁殖,pH,溫度,生長最適：25-37℃，產(chǎn)毒最適20-25 ℃

4、 ， 低于15 ℃ 或高于55 ℃ ，肉毒梭菌芽孢不能繁殖，不產(chǎn)生毒素,,,,,,危害污染，產(chǎn)毒條件,特性,肉毒梭菌作為食品安全監(jiān)測中的指標(biāo)菌,肉毒梭菌形成的芽孢對(duì)于高溫的抗性,肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒素對(duì)酸的抗性,肉毒梭菌能夠厭氧、低溫生長,肉毒素的毒性,,肉毒毒素是迄今已知的毒性最強(qiáng)的物質(zhì)，其小鼠LD50介于0.1~1ng/kg。純化結(jié)晶的肉毒毒素1mg能殺死2億只小鼠，對(duì)人的致死劑量約0.1μg。 其毒性是KCN的10000倍。

5、外毒素，活體肉毒桿菌是無法釋放肉毒素的，細(xì)胞裂解后釋放前體毒素,毒性,不穩(wěn)定因素,溫度、濕度，空氣和光照都會(huì)使毒素降解常規(guī)的消毒方法既能使其滅活 ——氯， 加熱85?C 5min人與人不能傳播存在肉毒素抗毒素 （但對(duì)已經(jīng)存在的癥狀無效）對(duì)堿性溶液很不穩(wěn)定,肉毒素的毒害及作用機(jī)理,引起肉毒中毒的食品，因飲食習(xí)慣、膳食組成、制作工藝不同而有差別： 美國：以罐頭食品引起中毒為主 日本：以魚制品中毒較多 歐洲：以臘腸

6、、火腿和保藏的肉類為主 我國：則是與發(fā)酵食品有關(guān)，如自制豆醬、豆腐乳和面醬等，有少數(shù)發(fā)生于各種不新鮮肉、蛋、魚類食品。 其次，薄膜包裝食品因其保存環(huán)境有利于肉毒梭菌繁殖，也能引起中毒。 另外，若肉毒梭菌毒素附著于水果、蔬菜和谷物或廚具上亦可引起中毒。,食品污染分布,1、 潛伏期：數(shù)小時(shí)至數(shù)天不等，一般為12～48 h，長者可達(dá)8--10天，主要決于動(dòng)物種類和攝入毒素的量。 2、主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)麻痹癥狀：視力減弱、

7、全身無力、伸舌和張口困難、抬頭費(fèi)力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。 3、發(fā)病快：食入毒素后，短的經(jīng)過6 h，長的2～10 天開始發(fā)病。肉毒中毒死亡率較高，一般為20-40%,中毒特征,肉毒素的結(jié)構(gòu),通過培養(yǎng)分離得到的毒素以前體毒素的形式存在：神經(jīng)毒素(Bont)、血凝素(HA)、非血凝素(NTNH)、RNA 神經(jīng)毒素(Bont)：神經(jīng)元底物特異性的催化活性 非毒素組分：主要是起到保護(hù)毒素活性的作用

8、 血凝素：維持毒素三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 還可能協(xié)助毒素穿過腸壁進(jìn)入血液和淋巴循環(huán),,肉毒素結(jié)構(gòu),前體毒素－900 KD 復(fù)合體HA (Haemagglutinin) ,血凝素NTNH non-toxic non-haemagglutinins 非血凝素蛋白,以鋅肽鏈內(nèi)切酶實(shí)施毒效,血凝素維持毒素三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定影響結(jié)構(gòu)因素：熱變性，堿性條件空氣/液體介面形成的氣泡改變毒素形

9、態(tài),,,,NH2,,NH2,,COOH,,S-S,,HeavyChain重鏈,LC輕鏈,Zn2+,LC中含有1個(gè)Zn2+結(jié)合序列Bont必須結(jié)合1個(gè)Zn2+才有活性；可用重金屬螯合劑使其失活Zn2+可被其它二價(jià)離子取代形成金屬替換毒素,肉毒素結(jié)構(gòu)——Zn2+,神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,Bont的抑制作用,神經(jīng)節(jié)苷脂,,雙受體假說,結(jié)合蛋白,A、B、E型研究證明,Bont通過酸性小泡 胞吞進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi),Bont 輕鏈逃離,3種假說

10、,,管道模型,裂縫模型,裂解模型,Bont的導(dǎo)入,Bont過特異性切割SNARE系列蛋白，抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放,機(jī)理總結(jié)總結(jié),注意食品來源 注意個(gè)人衛(wèi)生及食品處理 預(yù)防嬰兒傷口感染 可用肉毒梭菌類毒素預(yù)防注射：1ml/次，皮下注射，1次/周，共注射3次。 用食者發(fā)生肉毒中毒癥狀：應(yīng)立即注射多價(jià)肉毒抗毒血清1000--2000U，并去醫(yī)院就診，以防發(fā)病。,預(yù)防措施,肉毒桿菌的檢測方法,中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢

11、疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T2525-2010）----食品中肉毒梭菌的PCR檢測方法,原理,樣品,增菌培養(yǎng)分離,提取DNAPCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳,,,,易蔓延生長、有不規(guī)則邊緣，斜射光照射有虹彩樣厭氧培養(yǎng)，需用石蠟油密封,制樣增菌,分離純培養(yǎng)物,制備模板DNA,實(shí)驗(yàn)組:采用針對(duì)A、B、E、F型肉毒梭菌肉毒毒素基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行多個(gè)PCR擴(kuò)增，每個(gè)PCR反應(yīng)管檢測一種類型。對(duì)照組：以非肉毒梭菌基因組DNA為陰性對(duì)照，無菌水

12、為空白對(duì)照，含有Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因組DNA作陽性對(duì)照。,PCR擴(kuò)增,陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶。PCR結(jié)果陰性，可報(bào)告未檢出Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌。若結(jié)果為陽性則要進(jìn)行確證試驗(yàn)：確證試驗(yàn)結(jié)果為檢出肉毒梭菌，則報(bào)告檢出某型（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型）肉毒梭菌確證試驗(yàn)參照GB/T4789.12-2003,結(jié)果判定,肉毒毒素的檢測,小鼠生物學(xué)實(shí)驗(yàn)法1.樣品處理： 液體不用處理直接離心

13、得上清液，固體和半流動(dòng)檢樣加明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡，研碎后離心得上清液。調(diào)PH至6.2，加10%胰酶（9:1v/v）混勻，得胰酶激活處理液。2.檢出試驗(yàn)： 取上清液和胰酶激活處理液分別注射（0.5mL）小鼠三只，觀察四天。陽性：24h內(nèi)發(fā)病，死亡主要癥狀：豎毛，四肢癱軟，呼吸困難最終死于呼吸麻痹。,將陽性試驗(yàn)樣品分成三份： 第一份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清混勻， 第二份加等量明膠磷酸鹽緩沖液混勻，煮沸10min

14、, 第三份加等量的明膠磷酸鹽緩沖液混勻。三份混合液分別注射（0.5mL)小白鼠兩只，觀察4d。陽性：若一二兩份樣受試小鼠存活，而第三份死亡，則可判定肉毒素存在,確證實(shí)驗(yàn),取經(jīng)過確證實(shí)驗(yàn)的陽性樣品，用明膠磷酸鹽緩沖液做成5、50、500、5000倍的稀釋液，各注射兩只小鼠（方法同上）。根據(jù)動(dòng)物死亡情況計(jì)算大體的毒力（最小致死劑量MLD/mL或MLD/g)例：5、50、500倍的稀釋液致使小鼠全部死亡，5000倍稀釋液的受試動(dòng)

15、物全部存活，毒力大致為1000-10000MLD/mL。,毒力測定,將樣品稀釋至10-1000MLD/mL范圍分別與各單型肉毒抗毒診斷血清等量混勻，注射小鼠（方法同上），以緩沖液為陰性對(duì)照哪組實(shí)驗(yàn)小鼠存活，即說明該毒素是哪一種類型,定型實(shí)驗(yàn),應(yīng)用及展望,應(yīng)用,,眼瞼痙攣*,神經(jīng)肌肉,,美容*,多汗癥*,美容,美容,,除皺紋,瘦臉(腿),,動(dòng)態(tài)皺紋：3~6個(gè)月,衰老 X,其他 X,,肌肉萎縮,弊端,,疼痛、麻木、腫脹,表情呆板