寄生蟲實驗技術(shù)ppt課件

1、寄生蟲實驗技術(shù),病原學檢查血清學檢查,病原學檢查,糞便檢查 血液檢查法排泄物與分泌物等的檢查 其它組織器官檢查,糞便檢查,直接涂片法 厚涂片透明法濃聚法 沉淀法 毛蚴孵化法 浮聚法肛門拭子檢查法 試管濾紙檢查法蟲卵計數(shù)法 定量透

2、明法淘蟲檢查法 帶絳蟲孕節(jié)檢查法,,直接涂片法,檢查蠕蟲卵、原蟲包囊和滋養(yǎng)體。簡便，連作3次以提高檢出率。滴一滴生理鹽水于載玻片，用牙簽挑取綠豆大小的糞塊，在生理鹽水中涂抹均勻；厚度以可辨認下面的字跡為宜。也可固定后染色。一般在低倍鏡下檢查，用高倍鏡觀察時加蓋片。檢查包囊時用碘液。檢查隱孢子蟲卵囊時用金胺酚改良抗酸染色法。,厚涂片透明法,取約5mg糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油－孔雀

3、綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開。置于30～36℃溫箱中約半小時或25℃約1小時。待糞膜稍干，即可鏡檢。,沉淀法,原蟲包囊和蠕蟲卵等比重大時效果較好。重力（離心）沉淀法：取糞便20～30g，加水混懸后用2～3層濕紗布過濾；濾液靜置25分鐘或離心（1500～2000rpm）1～2分鐘，重復(fù)洗滌直至上清液清澈為止。最后取沉渣涂片鏡檢。檢查包囊時，換水間隔時間宜延長至約6h。,浮聚法,利用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液

4、體表面。檢查鉤蟲卵效果最好。飽和鹽水浮聚法：取黃豆粒大的糞便置于浮聚瓶中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口但不溢出為止。在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片迅速提起翻轉(zhuǎn)，鏡檢。可用硫酸鋅或蔗糖代替飽和鹽水。,毛蚴孵化法,在適宜溫度的清水中，血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴短時間內(nèi)可孵出。取糞便約30g，先經(jīng)沉淀法濃集，將糞便沉渣倒入三角燒瓶內(nèi)，加清水至瓶口，在20～30℃的條件下經(jīng)4～6小時后肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。

5、如水面下有白色點狀物作直線來往游動，即是毛蚴。必要時也可用吸管將毛蚴吸出鏡檢。,毛蚴促孵法,將沉淀法處理后的糞便沉渣置于三角瓶內(nèi)，不加水，或?qū)⒓S渣置于吸水紙上，再放在20～30℃溫箱中過液。檢查時，加清水，2小時后就可見到孵出的毛蚴。,肛門拭子檢查法,適于肛周產(chǎn)卵（蟯蟲），或肛門附近可發(fā)現(xiàn)蟲卵（帶絳蟲）的寄生蟲蟲卵檢查法。棉簽拭子法：將濕棉簽或角匙在肛門周圍擦拭，隨后將其放入盛有飽和鹽水的試管中充分溶解，然后取液面液體進行鏡檢，也可離

6、心后取沉渣鏡檢。透明膠帶法：用長約6cm，寬約2cm的透明膠帶粘擦肛門周圍皮膚，取下膠帶，平貼在玻片上鏡檢。,試管濾紙培養(yǎng)法,也稱鉤蚴培養(yǎng)法。根據(jù)鉤蟲卵在適宜條件下可在短時間內(nèi)孵出幼蟲的原理設(shè)計的方法。加水約1ml于潔凈試管內(nèi)，將濾紙剪成與試管等寬但管稍長的T字型紙條。取糞便約0.2～0.4g，均勻地涂抹在紙條豎條的上部2／3處，再將紙條插入試管，下端浸泡在水中，糞便不接觸水面。在20～30℃條件下培養(yǎng)3天后肉眼或放大鏡檢查試管底部

7、。鉤蚴在水中作蛇形游動，蟲體透明。,蟲卵計數(shù)法,斯陶爾（Stoll）氏法。在三角燒瓶的頸部畫56和60ml兩個刻度。先加0.1mol/L NaOH溶液至56ml處，再加糞便到60ml處，然后放進玻璃珠充分搖動混懸。取0.075或0.15ml糞液置于載玻片，鏡下計算蟲卵數(shù)。乘以200或100得每克糞便蟲卵數(shù)。 雌蟲數(shù)＝每克糞便蟲卵數(shù)×24小時糞便克數(shù)/  已知雌蟲每天排卵總數(shù)成蟲總數(shù)＝雌蟲總數(shù)

8、5;2,定量透明法,蠕蟲卵的檢查及計數(shù)。將約4×4cm的100目尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋糞便，自篩網(wǎng)上刮取糞便，填滿置于載玻片上的定量板的?？住Ｏ破鸲堪?，將留下的糞樣覆蓋一含甘油－孔雀綠溶液的約為5.0～2.6cm的玻璃紙條，展平加壓后糞便鋪成長橢圓形。經(jīng)1～2h糞便透明后鏡下計數(shù)。將所得蟲卵數(shù)×24，再乘糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲卵數(shù)。,淘蟲檢查法,考核驅(qū)蟲療效，糞便中淘取蠕蟲鑒定計數(shù)。取服藥后24～72小時

9、的全部糞便，加水攪拌，用篩（40目）或紗布濾出糞渣，經(jīng)水反復(fù)沖洗后，倒在盛有清水的大型玻皿內(nèi)。檢查混雜在糞渣中的蟲體時，應(yīng)在玻皿下襯以黑紙。,帶絳蟲孕節(jié)檢查法,絳蟲節(jié)片用清水洗凈，置于兩載玻片之間，輕輕壓平，對光觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并根據(jù)子宮分支情況鑒定蟲種。也可用注射器從孕節(jié)后端正中部插入子宮內(nèi)徐徐注射炭素墨汁或卡紅，待子宮分支顯現(xiàn)后計數(shù)。,血液檢查,診斷瘧疾、絲蟲病。皮膚消毒后用取血針刺破皮膚，擠出血滴，用載玻片蘸取。然后用一邊緣光

10、滑的載片為推片，將血滴推成血膜。充分晾干后，用甲醇或無水酒精對血膜進行固定。然后進行染色，晾干后鏡檢。,排泄物與分泌物的檢查,1．痰液　可查肺吸蟲卵、棘球蚴的原頭蚴、糞類圓線蟲幼蟲、蛔蚴、鉤蚴等。先用直接涂片法檢查，陰性時改用濃集法。濃集法：收集多量痰液置玻璃杯中，加入等量10％NaOH溶液，攪勻后置37℃溫箱內(nèi)消化，待痰液變?yōu)橄∫簳r分裝離心管內(nèi)，以1500rpm離心5～10分鐘，取沉渣涂片檢查。,排泄物與分泌物等的檢查,2．十二

11、指腸液和膽汁：檢查賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲卵、肝片形吸血卵和布氏姜片蟲卵等；可滴于載玻片上加蓋片后直接鏡檢。為提高寄生蟲檢出率，可加生理鹽水稀釋攪拌后，分裝離心管，以2000rpm離心5～10分鐘，取沉渣涂片鏡檢。如過于粘稠，先加10％NaOH消化后再離心。,排泄物與分泌物等的檢查,3．尿　腎蟲病等。一般離心后取沉渣鏡檢。乳糜尿時需加等量乙醚，用力振蕩使脂肪溶于乙醚。然后除去脂肪層后離心，取沉渣鏡檢。4．陰道分泌物：伊氏錐蟲、

12、陰道毛滴蟲等。直接涂片法。,其它器官組織檢查,1．骨髓：利什曼原蟲無鞭毛體等。直接涂片；甲醇固定，染色，油鏡檢查。2．淋巴結(jié)：利什曼原蟲、絲蟲成蟲：切面涂片，染色后鏡檢。3．直腸粘膜：日本血吸蟲卵及阿米巴滋養(yǎng)體等。從直腸粘膜病變組織取樣，壓片鏡檢或染色鏡檢。,其它器官組織檢查,4．肌肉壓片檢查：旋毛蟲幼蟲、豬囊尾蚴等。從腓腸肌或肱或股二頭肌取米粒大小的肌肉或肌肉結(jié)節(jié)，置于載玻片上，加50％甘油一滴，蓋上另一載玻片均勻用力壓緊，低倍鏡

13、下觀察。須立即檢查，否則幼蟲變得模糊，不易檢出。也可經(jīng)組織固定后作切片染色檢查。,其它器官組織檢查,5. 皮屑檢查：疥螨。用刀片刮取健康部和病患交界處的痂皮進行鏡檢（需出血）。直接檢查法：置平皿或黑紙上，曝曬或加熱（40-50℃ ），30-40分鐘后，移去皮屑檢查白色蟲體。顯微鏡鏡檢：置載玻片，滴加煤油、10％NaOH、液體石蠟，50％甘油后，上加另一載玻片按壓后檢查。蟲體濃集法：置試管中，加入10％ NaOH后過夜或加熱使皮

14、屑溶解，而后靜置或離心（2000rpm，5min）使蟲體沉淀后鏡檢。,免疫學方法,皮內(nèi)試驗染色試驗環(huán)卵沉淀試驗間接血凝試驗免疫熒光酶聯(lián)免疫吸附試驗斑點ELISA免疫酶染色試驗單克隆抗體,皮內(nèi)試驗,利用宿主的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，將特異抗原液注入皮內(nèi)，觀測皮膚丘疹及紅暈反應(yīng)以判斷有無特異抗體（IgE）的存在稱皮內(nèi)試驗。操作簡單，并且可即時觀察結(jié)果，適宜現(xiàn)場應(yīng)用。皮內(nèi)試驗用于多種寄生蟲病的檢測，如血吸蟲病、肺吸蟲病等。最常用于

15、血吸蟲病的調(diào)查。,染色試驗,染色試驗（dye  test，DT）：獨特的免疫反應(yīng)，是目前診斷弓形蟲病較好的方法，廣泛用于該病的臨床診斷和流行病學調(diào)查。新鮮弓形蟲滋養(yǎng)體和正常血清混合，在37℃1小時或室溫數(shù)小時后，大部分弓形蟲變?yōu)閳A形或橢圓形，用堿性美藍染色時著色很深。但新鮮弓形蟲和免疫血清混合時，蟲體仍保持原有形態(tài)，用堿性美藍染色時，著色很淺或不著色。,環(huán)卵沉淀試驗,以血吸蟲整卵為抗原的特異血清學試驗。卵內(nèi)毛蚴或胚胎分泌排

16、泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍形成特殊的復(fù)合物沉淀，在光鏡下判讀反應(yīng)強度并計數(shù)反應(yīng)卵的百分率（環(huán)沉率）。,間接血凝試驗,間接血凝試驗是以紅細胞作免疫配體的載體，并以紅細胞凝集進行讀數(shù)的血清學方法。最常用的紅細胞為綿羊或人（O型）紅細胞，IHA操作簡便，敏感性高，適于現(xiàn)場使用，可作為輔助論斷，流行病學調(diào)查及綜合診斷方法。在多種寄生蟲感染中應(yīng)用，如血吸蟲，瘧疾、豬囊蟲，旋毛蟲，肺吸蟲，阿米巴，弓形蟲，

17、肝吸蟲等。,免疫熒光法,免疫熒光法是對抗原抗體反應(yīng)進行特異熒光染色的診斷技術(shù)。診斷瘧疾、絲蟲病及血吸蟲病、肺吸蟲病、華支睪吸蟲病、包蟲病及弓形蟲病等。1．直接法：每查一種抗原必須制備與其相應(yīng)的熒光標記的抗體。目前很少應(yīng)用。2．間接法：也稱間接熒光抗體法。將抗原與未標記的特異性抗體（如患者血清）結(jié)合，然后使之與熒光標記的二抗（抗抗體）結(jié)合，三者的復(fù)合物可發(fā)出熒光。,酶聯(lián)免疫吸附試驗,廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液（血清，腦脊液等）以

18、及排泄分泌物（尿，乳，糞便等）內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測。酶聯(lián)試驗的基本操作過程可分為：①固相包被；②溫育洗滌；③加樣；④酶結(jié)合物反應(yīng)；⑤底物顯色；⑥終止反應(yīng)讀取結(jié)果等若干步驟。,斑點ELISA,斑點ELISA（dot-ELISA）是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù)，在固相載體上吸附抗原和抗體，然后和被測物反應(yīng)，底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色，目測或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來檢測抗體，也可用來檢測抗原，由于

19、該法檢測抗原時操作較簡便，故目前多用于抗原檢測。,免疫酶染色試驗,免疫酶染色試驗是以組織切片，印片或培養(yǎng)物涂片用作待檢材料進行過氧化物酶特異免疫染色，在光鏡下檢示樣本的特異性抗原。在蠕蟲和原蟲感染中均有應(yīng)用。血吸蟲病、絲蟲病、囊蟲病、華支囊吸蟲病、肺吸蟲病、包蟲病和弓形蟲病等。,單克隆抗體,單克隆抗體（McAb）廣泛用于寄生蟲病臨床與實驗研究。分型和鑒定；免疫診斷方法以及寄生蟲感染免疫，保護性免疫和蟲苗制備等方面。用于瘧疾、弓形蟲病

20、、血吸蟲病、肺吸蟲病、棘球蚴病、絲蟲病等方面。,檢測新技術(shù)－分子生物學方法,免疫印漬試驗DNA探針技術(shù)PCR技術(shù),免疫印漬試驗,免疫印漬試驗是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），電泳轉(zhuǎn)印及標記免疫試驗三項技術(shù)結(jié)合而成的一種新型的免疫探針技術(shù)，是分析蛋白抗原、鑒別生物學活性抗原組分的有效方法。應(yīng)用于檢測寄生蟲感染宿主體液內(nèi)針對某抗原的抗體，是一項高敏感和高特異的診斷方法，具有很大發(fā)展?jié)摿Α?DNA探針技術(shù),DNA

21、探針技術(shù)，又稱核酸分子雜交技術(shù)，敏感性高，特異性強，應(yīng)用面廣。在寄生蟲病診斷中，探針是病原體的特異核酸序列，可用來檢測出病原體是否存在。在寄生蟲病的診斷、現(xiàn)場調(diào)查、寄生蟲種的鑒定及分類等方面的研究中均已使用。,PCR技術(shù),檢測病原體遺傳物質(zhì)用以診斷寄生蟲病的方法，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase   chain  reaction，PCR）是一種體外擴增特異性DNA技術(shù)?，F(xiàn)已使用PCR技術(shù)于寄生蟲病診