干細(xì)胞示蹤技術(shù)進(jìn)展

1、干細(xì)胞示蹤技術(shù)進(jìn)展,吳海東,干細(xì)胞示蹤技術(shù)進(jìn)展,大量動物和臨床研究均表明干細(xì)胞移植確實能改善心、腦和肝等器官功能，干細(xì)胞移植治療器官功能缺損性疾病如缺血性心臟病、心力衰竭 （心衰），腦血管疾病、腦損傷、肝硬化或肝功能衰竭，神經(jīng)損傷等級已成為21世紀(jì)醫(yī)學(xué)的標(biāo)志性成果。然而， 評價細(xì)胞植入、分布、存活、遷移、分化和功能的干細(xì)胞標(biāo)記示蹤研究明顯滯后于整體功能改善的觀察，成為干細(xì)胞治療機(jī)制探討的瓶頸因素和新的研究熱點。,示蹤方法,體外示蹤（病理

2、學(xué)示蹤）體內(nèi)示蹤：MR、核素顯像、光學(xué)成像,病理學(xué)示蹤,移植前體外預(yù)先標(biāo)記培養(yǎng)的干細(xì)胞，包括熒光染料標(biāo)記 （標(biāo)記細(xì)胞核或細(xì)胞膜） 核素標(biāo)記方法 Y染色體標(biāo)記報告基因轉(zhuǎn)染,細(xì)胞核標(biāo)記物,5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU） 標(biāo)記DAPI標(biāo)記Hoechst 染色,BrdU標(biāo)記,BrdU是DNA 前體胸腺嘧啶核苷的同類物， 能與內(nèi)源性胸腺嘧啶競爭性地參與1 期細(xì)胞單鏈DNA合成從而標(biāo)記細(xì)胞核， 細(xì)胞核免疫熒光染色后利用熒光顯

3、微鏡或激光共聚焦顯微鏡發(fā)射一定波長紫外光激發(fā)后觀察， 亦可通過免疫組化染色識別BrdU鑒定移植細(xì)胞。,BrdU標(biāo)記,BrdU標(biāo)記,DAPI標(biāo)記,DAPI熒光染料化學(xué)名稱為4’，6聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4’‘6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI）,能與富含A-T堿基對DNA專一結(jié)合從而標(biāo)記細(xì)胞核， 紫外光激發(fā)下發(fā)出淺藍(lán)色熒光。,DAPI標(biāo)記,優(yōu)點： （1） 熒光保持時間較長、 專

4、一性強(qiáng)、靈敏度高； （2） 標(biāo)記技術(shù)簡單， 標(biāo)記效率高。缺點：細(xì)胞分裂將導(dǎo)致DAPI標(biāo)記強(qiáng)度降低、 靈敏度下降。僅適于短期定量分析。且標(biāo)記的細(xì)胞死亡后可釋放出DAPI， 將周圍未標(biāo)記的細(xì)胞標(biāo)記從而產(chǎn)生假陽性。,,DAPI標(biāo)記,Hoechst染色,Hoechst是能與DNA A-T堿基對特異性結(jié)合的雙苯并咪唑熒光染料， 細(xì)胞核著色， 紫外光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光。 優(yōu)點：染色快（1~3h）， 標(biāo)記率100%， 可標(biāo)記成體干細(xì)胞， 常用

5、的有Ho33342和Ho33258。存在的問題主要是部分干細(xì)胞對該染料拒染。,Hoechst染色,細(xì)胞膜標(biāo)記,Dil標(biāo)記：是一種親脂性碳花青染料， 以類似于磷脂的方式與脂蛋白結(jié)合嵌進(jìn)生物質(zhì)膜內(nèi)， 并在膜內(nèi)做定向擴(kuò)散運(yùn)動從而標(biāo)記整個細(xì)胞。其特點是特異性強(qiáng)， 靈敏度高。CM-Dil作為膜標(biāo)記物存在把標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到未標(biāo)記細(xì)胞的現(xiàn)象，10umol/L標(biāo)記濃度10d 是安全的， 之后就開始轉(zhuǎn)移到非標(biāo)記細(xì)胞；40umol/L濃度1 周就開始轉(zhuǎn)移，

6、 而且活細(xì)胞之間、 活細(xì)胞與死細(xì)胞之間都有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。因此， CM-Dil比較適合短期的標(biāo)記示蹤。,CM-Dil膜標(biāo)記,PKH26、PKH67標(biāo)記,PKH26、PKH67分別是紅色、 綠色的親脂性碳花青熒光染料，與細(xì)胞膜的脂質(zhì)區(qū)域能穩(wěn)定結(jié)合，清晰地顯現(xiàn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。因熒光染料會隨著隨干細(xì)胞的增生和分化、時間的流失而稀釋淬滅，在一定時間將檢測不到標(biāo)記的細(xì)胞，PKH26、PKH67被應(yīng)用于體內(nèi)外的短期細(xì)胞追蹤研究,PKH26標(biāo)記,熒光染料標(biāo)記

7、方法,優(yōu)點：化學(xué)性結(jié)合， 容易操作， 對細(xì)胞的增殖和分化基本沒有影響。缺點： 1. 隨著干細(xì)胞的增生和分化而稀釋， 隨時間的流失而淬滅， 以至于最終完全不能檢出， 因而不適合做長時期的體內(nèi)標(biāo)記追蹤。2.細(xì)胞在受體內(nèi)是否存活難以證明， 因為標(biāo)記細(xì)胞凋亡或死亡后可釋放標(biāo)記物標(biāo)記周圍細(xì)胞造成假陽性， 而且被巨噬細(xì)胞吞噬后， 細(xì)胞碎片在巨噬細(xì)胞內(nèi)也可以有熒光表達(dá)。3. 此類熒光標(biāo)記只能判斷細(xì)胞的存在， 無法觀察細(xì)胞形態(tài)。,核素標(biāo)記—可用

8、于體內(nèi)外示蹤,目前常用來示蹤標(biāo)記的核素有3H-、125I-、14C-、99mTc、32P-等， 其中以氚標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶核苷 （3H-TDR） 應(yīng)用最為廣泛， 主要用于檢測干細(xì)胞的細(xì)胞動力學(xué)和增殖研究。細(xì)胞增殖時需攝取各種嘧啶核苷，3H-TDR作為 DNA補(bǔ)救合成的前體， 可較特異地在 S期摻入細(xì)胞 DNA 中。干細(xì)胞分裂增殖快，3H-TDR 易被摻入標(biāo)記。核素標(biāo)記干細(xì)胞移植治療后在同一張切片上作放射自顯影+免疫組化也可觀察移植細(xì)胞在

9、體內(nèi)的分布、 遷移情況。核素示蹤靈敏度高， 可以穩(wěn)定長期地示蹤。存在的問題是有一定的放射性污染， 檢測復(fù)雜。,,Y染色體標(biāo)記,目前國際上比較認(rèn)可的Y染色體標(biāo)記細(xì)胞追蹤移植細(xì)胞技術(shù)是選用雄性供體和雌性宿主， 利用Y染色體作為標(biāo)志物。優(yōu)點：標(biāo)記技術(shù)簡單，且標(biāo)記效率很高， 利用熒光原位雜交（FISH） 技術(shù)進(jìn)行追蹤熒光標(biāo)記的細(xì)胞能清楚地觀察到， 適合長期體內(nèi)試驗定量分析。存在的問題是不能觀察自體細(xì)胞移植研究， 且追蹤異體移植細(xì)胞時需要雄

10、性供體， 雌性宿主， 有較大的局限性。,Y染色體,報告基因轉(zhuǎn)染,利用基因載體將標(biāo)志基因?qū)敫杉?xì)胞中， 通過篩選獲得表達(dá)標(biāo)志基因的細(xì)胞， 然后通過熒光顯微鏡可直接觀察移植細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)情況， 此類標(biāo)志基因主要有綠色熒光蛋白 （green fluorescent protein, GFP） 、B-半乳糖苷酶等，以GFP應(yīng)用最廣泛。,報告基因轉(zhuǎn)染,綠色熒光蛋白,,聶君，李勁松，王建軍，等. 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和示蹤標(biāo)記[J]

11、. 中華實驗外科雜志,2010,27(10):1432-1435.,攜帶EGFP基因慢病毒載體能高效感染MSCs,EGFP可作為MSCs體內(nèi)研究的示蹤標(biāo)記.,體內(nèi)跟蹤，分子成像技術(shù),MRICTNUCLEAR MEDICINE（PET）Ultrasonography (USG) OPTICAL IMAGING,分子成像技術(shù),自1999 年 Weissleder提出分子影像學(xué)概念以來， MRI、核醫(yī)學(xué)成像和光學(xué)成像蓬勃發(fā)展， 因還未

12、研發(fā)針對干細(xì)胞特異性或相對特異性標(biāo)志分子的示蹤劑， 核醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用較少。目前在干細(xì)胞示蹤研究中應(yīng)用較多的主要是磁標(biāo)記細(xì)胞MRI示蹤成像和光學(xué)成像， 但光學(xué)成像尚處于僅應(yīng)用于小動物實驗性成像階段。,,核磁共振成像原理,原子核帶有正電，許多元素的原子核，如1H、19FT和31P等進(jìn)行自旋運(yùn)動。通常情況下，原子核自旋軸的排列是無規(guī)律的，但將其置于外加磁場中時，核自旋空間取向從無序向有序過渡。自旋系統(tǒng)的磁化矢量由零逐漸增長，當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到平衡時，

13、磁化強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定值。如果此時核自旋系統(tǒng)受到外界作用，如一定頻率的射頻激發(fā)原子核即可引起共振效應(yīng)。在射頻脈沖停止后，自旋系統(tǒng)已激化的原子核，不能維持這種狀態(tài)，將回復(fù)到磁場中原來的排列狀態(tài)，同時釋放出微弱的能量，成為射電信號，把這許多信號檢出，并使之能進(jìn)行空間分辨，就得到運(yùn)動中原子核分布圖像。原子核從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)的過程叫弛豫過程。它所需的時間叫弛豫時間。弛豫時間有兩種即T1和T2，T1為自旋-點陣或縱向馳豫時間，T2為自旋-

14、自旋或橫向弛豫時間。,核磁共振成像原理,磁共振最常用的核是氫原子核質(zhì)子（1H），因為它的信號最強(qiáng)，在人體組織內(nèi)也廣泛存在。影響磁共振影像因素包括：(a)質(zhì)子的密度；(b)弛豫時間長短；(c)血液和腦脊液的流動；(d)順磁性物質(zhì)(e)蛋白質(zhì)。磁共振影像灰階特點是，磁共振信號愈強(qiáng)，則亮度愈大，磁共振的信號弱，則亮度也小，從白色、灰色到黑色。各種組織磁共振影像灰階特點如下；脂肪組織，松質(zhì)骨呈白色；腦脊髓、骨髓呈白灰色；內(nèi)臟、肌肉呈灰白色；液體

15、，正常速度血液呈黑色；骨皮質(zhì)、氣體、含氣肺呈黑色?！　『舜殴舱竦牧硪惶攸c是流動液體不產(chǎn)生信號稱為流動效應(yīng)或流動空白效應(yīng)。因此血管是灰白色管狀結(jié)構(gòu)，而血液為無信號的黑色。這樣使血管很容易軟組織分開。正常脊髓周圍有腦脊液包圍，腦脊液為黑色的，并有白色的硬膜為脂肪所襯托，使脊髓顯示為白色的強(qiáng)信號結(jié)構(gòu)。核磁共振已應(yīng)用于全身各系統(tǒng)的成像診斷。效果最佳的是顱腦，及其脊髓、心臟大血管、關(guān)節(jié)骨骼、軟組織及盆腔等。對心血管疾病不但可以觀察各腔室、大血管

16、及瓣膜的解剖變化，而且可作心室分析，進(jìn)行定性及半定量的診斷，可作多個切面圖，空間分辨率高，顯示心臟及病變?nèi)?，及其與周圍結(jié)構(gòu)的關(guān)系，優(yōu)于其他X線成像、二維超聲、核素及CT檢查。在對腦脊髓病變診斷時，可作冠狀、矢狀及橫斷面像。,MRI活體示蹤磁標(biāo)記細(xì)胞,MRI活體示蹤移植干細(xì)胞前提是需用MR對比劑磁化標(biāo)記細(xì)胞， 以使能與宿主細(xì)胞相區(qū)分。MR對比劑1.主要產(chǎn)生T1正性對比效應(yīng)的Gd3+，檢測閥值過高，實用價值不大。2. T2 負(fù)性對比

17、效應(yīng)，但對 T1 弛豫的加快作用較弱：通過葡聚糖生物高分子包裹 Fe3O4 晶體形成核殼式結(jié)構(gòu)的超順磁性氧化鐵 （Superparamagnetic iron oxide，SPIO）納米材料(Feridex）。3. 氯化錳：有一定的細(xì)胞毒性。標(biāo)記方法簡單，有獨(dú)特的成像功能。,釓-熒光雙標(biāo)記及MRI體外示蹤,釓-熒光雙標(biāo)記及MRI體外示蹤,沈君，周翠屏，成麗娜，等. 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的釓-熒光雙標(biāo)記及MRI體外示蹤的研究[J]. 中

18、華放射學(xué)雜志,2008,42(4):426-431.,磁標(biāo)記細(xì)胞MR成像原理,具有超順鐵磁性的Fe3O4晶體低濃度即能顯著地造成局部磁場的不均勻， 使鄰近氫質(zhì)子在弛豫中很快產(chǎn)生相散， 加速了質(zhì)子去相位過程， 縮短了組織的T2值， 在梯度回波和自旋回波序列MRI中， 使組織信號降低從而產(chǎn)生較強(qiáng)的T2 負(fù)性對比效應(yīng)， 常規(guī)1.5T MR成像就能顯示被標(biāo)記的干細(xì)胞， 但SPIO對 T1 弛豫的加快作用較弱。SPIO在體內(nèi)可生物降解被細(xì)胞代謝

19、， 示蹤細(xì)胞至少可達(dá) 3個月， 假陽性低。因此，MRI示蹤磁標(biāo)記細(xì)胞是活體內(nèi)最理想的細(xì)胞示蹤方法。,磁共振示蹤突出的優(yōu)勢,極佳的空間分辨力,掃描能明確部位，實時顯像并連續(xù)跟蹤標(biāo)記的細(xì)胞。能用于導(dǎo)向治療和跟蹤。檢測細(xì)胞閾值遠(yuǎn)低于有效治療劑量。磁共振細(xì)胞示蹤時間不僅與細(xì)胞轉(zhuǎn)歸相關(guān)， 還與細(xì)胞內(nèi)鐵含量、 局部注射細(xì)胞量、 磁共振儀器分辨力、 成像條件調(diào)節(jié)有關(guān)。,MRI示蹤存在的問題,尚無磁共振示蹤應(yīng)用于人類臨床試驗的報道原因： （1

20、）安全性有待進(jìn)一步研究： 雖然大部分研究表明順磁性鐵標(biāo)記后不影響干細(xì)胞的活性、 增殖和向其他細(xì)胞的分化能力， 但也有作者報道標(biāo)記后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化能力受損。（2）靈敏度相對不足（3）非特異性顯像：標(biāo)記干細(xì)胞在體內(nèi)死亡、 裂解， 釋放出的氧化鐵顆粒能否造成非特異性顯像尚無定論。,不能長期示蹤,由于氧化鐵不能夠跟隨細(xì)胞的分裂而自體復(fù)制， 所以在監(jiān)測移植后干細(xì)胞的增殖和分化方面存在一定不足。,本科的研究結(jié)果,,,,朱文珍

21、，李祥，漆劍頻，等. 以超順磁性氧化鐵標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞移植后的磁共振成像示蹤研究[J]. 中華器官移植雜志,2007,28(5):299-302.,,Modo M, Mellodew K, Cash D, et al. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study[J]

22、. NeuroImage,2004,21(1):311-317.,,黃浙勇，葛均波，楊姍，等. 超順磁性氧化鐵標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞心肌移植的磁共振成像研究[J]. 中華心血管病雜志,2007,35(4):344-349.,,黃浙勇，葛均波，楊姍，等. 超順磁性氧化鐵標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞心肌移植的磁共振成像研究[J]. 中華心血管病雜志,2007,35(4):344-349.,,MRI示蹤細(xì)胞的敏感性不夠理想，心肌內(nèi)局部注射的顯像閥值為1*105

23、。局部移植遷移量有限，如何才能敏感的反映出少量細(xì)胞的活動？ 黃浙勇，葛均波，楊姍，等. 超順磁性氧化鐵標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞心肌移植的磁共振成像研究[J]. 中華心血管病雜志,2007,35(4):344-349.,fluorescent-magnetite-nanocluster(FMNC),增強(qiáng)敏感性的方法—納米材料包裹法,,增強(qiáng)敏感性的方法—納米材料包裹法,FMNC,,,跟蹤時間短,細(xì)胞自健側(cè)向受損區(qū)遷移,檸檬酸鹽包裹的SP

24、ION,錳離子增強(qiáng)磁共振成像,Mn2+作為強(qiáng)順磁性鈣離子競爭劑,可以通過鈣離子通道進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞,并可通過軸突、突觸運(yùn)輸,減少含Mn2+組織的T1值,從而增強(qiáng)區(qū)域T1加權(quán)MRI信號.目前,MEMRI主要用于三方面的研究:活動誘導(dǎo)觀察腦的功能活動,在體、動態(tài)地追蹤神經(jīng)傳導(dǎo)通路,并可以精細(xì)觀察腦部形態(tài)學(xué).MEMRI在多領(lǐng)域的研究結(jié)果表明它是探測生物體內(nèi)的分子過程和大腦功能活動的重要工具和手段.錳亦可作為干細(xì)胞體內(nèi)移植的示蹤劑，但目前研究

25、較少，而且錳有一定的毒性，合適的濃度和劑量須待進(jìn)一步研究。,放射性核素顯像示蹤,放射性核素顯像示蹤在心臟細(xì)胞移植中的應(yīng)用： 核素標(biāo)記的優(yōu)點是背景信號低， 信噪比較高， 能檢測經(jīng)血管注射后向缺血心肌歸巢的少量干細(xì)胞。用于標(biāo)記心臟治療細(xì)胞的核素有111銦（111In）、锝依莎美肟 （99mTc-HMPAO）、 18氟-脫氧葡萄糖 （18F-FDG）等。單光子發(fā)射計算體層攝影（SPECT）可示蹤細(xì)胞一直到注射后 3 天， 但臨床磁共振機(jī)未能

26、對 Feridex標(biāo)記干細(xì)胞顯像。說明靜脈注射后真正分布到心臟的標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量有限， 磁共振成像敏感性不如核素顯像。,目前存在的問題,核素標(biāo)記也可能對治療細(xì)胞有放射性損害， 甚至有癌變的潛在危險。損害的大小與放射性元素的物理學(xué)特性和特定細(xì)胞的易感性有關(guān)。核素半衰期短（18F-FDG 110 min）， 損害小， 但成像觀察時間也相應(yīng)縮短。111In半衰期較長 （67 h） 加上β射線短， 已有報道損害造血干細(xì)胞的增殖分化， 但對內(nèi)皮祖

27、細(xì)胞似乎沒影響。,放射性核素顯像示蹤,和磁共振示蹤相反， 放射性核素顯像靈敏度較高， 能檢測標(biāo)記細(xì)胞的生物學(xué)分布， 包括外周血管注射后歸巢到心肌的細(xì)胞百分比， 但觀察時間受核素衰減的制約， 且空間分辨力低。存在非特異性顯像： 成像信號與細(xì)胞存活并不直接相關(guān)， 各種原因引起的核素標(biāo)記物從細(xì)胞釋放將導(dǎo)致非特異性信號的產(chǎn)生， 甚至在細(xì)胞死亡后仍有可能觀察到成像信號。其次， 細(xì)胞分裂對影像學(xué)的影響也尚未明了。,報告基因顯像,原理：在體外用各種

28、載體技術(shù)將報告基因轉(zhuǎn)移入待移植細(xì)胞， 檢測報告基因的表達(dá)率后注入體內(nèi)，通過靜脈注射特異性核素標(biāo)記的報告探針便可檢測出表達(dá)報告基因的移植細(xì)胞。優(yōu)點：由于報告探針的積聚依賴于報告基因的表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的活性， 因此信號強(qiáng)度與治療細(xì)胞的活性相關(guān)， 這種特異性檢測能力是直接標(biāo)記不可比擬的。況且， 檢測不受時間的限制， 可反復(fù)進(jìn)行， 而直接標(biāo)記存在核素衰減、 鐵制劑釋放導(dǎo)致示蹤周期短的缺陷。,報告基因最大的挑戰(zhàn),是如何保證影像信號的強(qiáng)度和穩(wěn)定

29、性。與直接標(biāo)記不同， 報告基因顯像需要注射報告探針，報告探針在靶細(xì)胞的積聚有賴于體內(nèi)的生物學(xué)過程。與直接心肌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)相比， 靶位置中少量存活植入細(xì)胞的報告基因表達(dá)量極少， 需要增加報告探針的劑量， 而這勢必增加非特異性背景信號。光學(xué)顯像雖能敏感檢測少量細(xì)胞， 但不能斷層成像， 不能應(yīng)用于大動物或人類。另外， 核素報告基因顯像需要較大量的細(xì)胞。,理想的活體細(xì)胞示蹤劑,（1）安全性： 不影響細(xì)胞存活、 生長、 分化及其他生物學(xué)作用；

30、不影響細(xì)胞基因組成； 有其清除途徑； 如從攜帶細(xì)胞釋放， 不影響周圍組織和受者。（2）靈敏度： 能準(zhǔn)確反映少量標(biāo)記細(xì)胞的行為 （包括位置、 移行） 和標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量等。（3）特異性： 能反映標(biāo)記細(xì)胞外移、 死亡或被巨噬細(xì)胞吞噬等情況， 間質(zhì)對標(biāo)記細(xì)胞或標(biāo)記物的非特異性處置不應(yīng)對靶細(xì)胞數(shù)量和生物學(xué)活動造成錯誤判斷。,理想的活體細(xì)胞示蹤劑,（4）長久性： 示蹤時間較長， 標(biāo)記物不會自動衰減或隨細(xì)胞分裂而稀釋， 可用非侵入性方法反復(fù)探測示