農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用真菌在自然界具有重要的地位，它是不同生態(tài)環(huán)境中的最初分解者之一。真菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。例如，在生物技術(shù)領(lǐng)域，可以利用真菌生產(chǎn)對(duì)人類有益的次級(jí)代謝產(chǎn)物抗生素、紫杉醇等；在植物病理學(xué)研究領(lǐng)域，許多真菌本身就是人類、動(dòng)物及植物的病原菌；一些真菌可作為生防劑控制病蟲害的發(fā)生。構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）和粗糙鏈孢霉（Neurosp

2、acrassa）由于結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，一般作為模式生物用于基礎(chǔ)性的分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的研究[1]。但從自然界直接分離的菌株和通過常規(guī)育種得到的菌株在多種性狀上并不能滿足人們的需要，而通過常規(guī)方法用真菌生產(chǎn)異源蛋白更難以實(shí)現(xiàn)[2]。論文檢測(cè)。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化具有效率高，成本低，操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)[34]，大大提高了真菌的轉(zhuǎn)化效率，增加了轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性，為研究真菌基因功能，分離克隆相關(guān)基因提供了一條嶄新的途徑。二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌

3、遺傳轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)農(nóng)桿菌是一種土壤習(xí)居菌，在自然條件下可以通過病斑或傷口進(jìn)入寄主組織，刺激寄主在侵染部位形成冠癭瘤，引發(fā)根癌病。冠癭瘤的生成，是由于農(nóng)桿菌染色體外遺傳物質(zhì)Ti質(zhì)粒上的一段DNA(TDNA)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，整合進(jìn)染色體組并進(jìn)行表達(dá)的結(jié)果。TDNA整合到真菌基因組的方式分為兩種，一種為同源重孢霉素)上，其中用一定濃度頭孢霉素殺死農(nóng)桿菌、適量選擇劑(如潮霉素)用于篩選轉(zhuǎn)化子，再繼續(xù)培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)(deGroot，1998)，并

4、且根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出轉(zhuǎn)化效率。最后將抗性菌落轉(zhuǎn)移至新鮮含有適宜抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)[6]。四、農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的鑒定隨機(jī)挑選抗性菌落轉(zhuǎn)接到含一定濃度潮霉素B的PDA平板上，培養(yǎng)至產(chǎn)孢。挑少量孢子分別在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行稀釋涂平板，待平板上長(zhǎng)出肉眼可以看到的菌落時(shí)，從各稀釋板中各挑取一個(gè)菌落到新的PDA平板上，培養(yǎng)至產(chǎn)孢后，重復(fù)上述單孢分離和挑單孢培養(yǎng)過程24次，進(jìn)行最后一輪單孢分離之后從各菌株的單孢分離板上隨機(jī)挑取單孢點(diǎn)接到含一定

5、濃度的潮霉素B的PDA平板上培養(yǎng)，觀察各板上單孢分離菌塊的生長(zhǎng)情況，若所有菌塊都生長(zhǎng)則說明該轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，反之則表明該菌株不具有遺傳穩(wěn)定性，若部分菌塊生長(zhǎng)則表明TDNA插入存在分化現(xiàn)象。以真菌菌株作對(duì)照。挑取野生型真菌菌株和假定轉(zhuǎn)化子菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)孢，向平板中加入適量滅菌水洗下分生孢子，吸取適量孢子液接種到盛有PDA培養(yǎng)基的三角瓶中震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物利用真空抽濾泵收集菌體，收集的菌體用滅菌蒸