重組e.coli產(chǎn)膽固醇氧化酶的提取、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究

1、江南大學(xué)碩士學(xué)位論文重組E.coli產(chǎn)膽固醇氧化酶的提取、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究姓名：鐘學(xué)敏申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：王武20090601A b s t r a c tA b s t r a c tC h o l e s t e r o lo x i d a s e ( E C 1 ．1 ．3 ．6 ，C O D ) i st h ek e ye n z y m eo fd e g r a d a t i o nc h o

2、l e s t e r o l ，w h i c hr e l y o nt h e c o e n z y m eF A D ．t oc a t a l y z e c h o l e s t e r 0 1 i n t o 4 - c h o l e s t e r o l - 3 - o n e ．T h es i g n i f i c a n tf u n c t i o n so fc h o l e s t e r o l

3、o x i d a s e ( E C 1 ．1 ．3 ．6 ，C O D ) i n f o o dp r o c e s s i n g ，m e d i c a la s s a ya n db i o l o g i c a lp e s t - r e s i s t a n c ew e r er e c o g n i z e dg r a d u a l l ya n ds h o w e d p o t e n t i

4、 a l l yu s e ．T m S r e s e a r c hi s m a i n l yf o c u s e do nC O D p u r i f i c a t i o n f r o mr e c o m b i n a n tE c o l i ．e n z y m a t i cp r o p e r t i e s ，a n d a p p l i c a t i o no f C O D ．T h ee x

5、 t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fi n t r a c e l l u L a rC O D f r o mr e c o m b i n a n tE c o l i w e r ep e r f o m e d ．C O D W a se x t r a c t e db y u L t r a s o n i ct r e a t m e n t ，7 0 ％a m m

6、 o n i u m s u L f a t ep r e c i p i t a t i o n ，a n dp u r i f i e d t h r o u g hD E A ES e p h a r o s eF ．F ' S e p h a d e xG - 7 5 ．T h ef i n a l s p e c i f i c a c t i v i t y o fC O D W a s4 7 ．3 U ／m g ．

7、a n d 4 5 - f o l dc o n c e n t r a t i o nw a so b t a i n e d w i t h e n z y m a t i c a c t i v i t yr e c o v e r y o f2 1 ％．As i n g l eM D H p r o t e i nb a n dW a ss h o w no nS D S —P A G Eg e lf i n a l l y ,

8、 t h em o l e c u L a r w e i g h t o f t h ee n z y m e W a s 5 0K D m e a s u r e d b v S D S ．P A G E ．E n z y m a t i cp r o p e r t i e sa n ds t a b i l i t i e so f e x t r a c t e di n t r a c e l l u L a rC O D

9、f r o mr e c o m b i n a n tE c o l iw a r es t u d i e d ．T h ee n z y m eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n d p Hw e r e3 7 ℃a n d 7 ．5 ．t h ee n z y m eh a sg o o ds t a b i l i t y w h e n t h et e

10、m p e r a t u r eu n d e r4 0 ℃．M e a n w h i l e ．t h ee n z y m ea c t i v i t yi Sr e l a t i v e l ys t a b l ei nt h ep H r a n g ef r o m6 ～9 ．T h em e t a lc a t i o nh a s a d i f f e r e n t i m p a c to nt h ee

11、 n z y m ea c t i v i t y , C O DW a ss t r o n gi n h i b i t e d b ym e t a li o n s s u c ha sA g + a n dH 曠+ ，w h i l eC 一+ ．F e ’+ ．C u + h a dl i t t l ee f f e c t o nC O D ．硼1 ee n z y m ek i n e t i cp a r a m e

12、 t e r sK m a n dV m a xv a l u e s w e r e 8 ．2 ×1 0 ．5m o l ／L a n d 0 ．2 1m m o l ／化·r n i n ) ．T h eC O D W a sa p p l i e d t o r e m o v a lt h ec h o l e s t e r o lo f e g g y o l k ．1 1 1 eb e s tm o b

13、 i l ep h a s ec o n d i t o n s o f i s a c e t o n i t r i l e ：m e t h a n o l ：i s o p r o p y l a l c o h o l 5 0 ：8 0 ：1 0 ．w h i c h i s u s e d f o rd e t e r m i n a t i o nt h e c h o l e s t e r o lc o n t e n

14、 to fe g gy o l k b yH P L C ，a n de s t a b l i s h e dt h es t a n d a r dc u r v eo f c h o l e s t e r 0 1 ．A tt h es a m e t i m e ，t h e e f f e c t s W a s c o m p a r e d b e t w e e nu L t r a s o n i ct r e a t

15、 m e n t a n dc o m p a r i s o n ，r e s u L t ss h o w e dt h es e p a r a t i o nr a t e o fc h o l e s t e r o lb yu L t r a s o n i ct r e a t m e n t i S 1 ．6t i m e s t h a n t h ec o m p a r i s o n ．1 1 1 eu l t

16、r a s o n i c t r e a t m e n tc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d ．t h eo p t i m a lv o l u m ea n d t i m eo f u L t r a s o n i ct r e a t m e n ta r e3 0 m L ．1 5 m i n ．U n d e rt h eo p t i m u mo p e r a t i

17、o n a l c o n d i t i o n s ：缸e a t m e n tt i m eo f 9 h 、C O D c o n c e n t r a t i o n o f 、．0 7 u | g ( C O D c o n t e n t |e g g y o l k ) ．t h ec o n v e r s i o nr a t eo f c h o l e s t e r o l W a s m o r et h

18、 a n8 0 ％．T h e m a j o r n u t r i e n t s d i dn o tc h a n g e a f t e re n z y m e t r e a t m e n t ，t h eo x i d a t i o n p r o d u c t s i s 4 - c h o l e s t e r 0 1 ．3 ．o n e ．K e y w o r d s ：r e c o m b i n a