骨靶向多肽復(fù)合煅燒骨支架修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、骨靶向多肽的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)骨靶向多肽的成骨活性
　　方法：采用ALP活性檢測(cè)及染色、RT-PCR、Western Blot檢測(cè)骨靶向多肽促進(jìn)MC3T3-E1成骨分化能力。
　　結(jié)果：
　　1.骨靶向多肽能顯著提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞的ALP活性（P＜0.05）。
　　2.骨靶向多肽能顯著上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞ALP、COL-1、RUNX2 mRNA表達(dá)量（P＜0

2、.05）。
　　3.骨靶向多肽能顯著上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞ALP、COL-1、RUNX2蛋白表達(dá)量（P＜0.05）。
　　結(jié)論：骨靶向多肽具有較好的成骨活性。
　　第二部分、骨靶向多肽/煅燒骨支架的制備和評(píng)價(jià)
　　目的：研究煅燒骨（TBC）支架的理化性質(zhì)并構(gòu)建骨靶向多肽/TBC支架，評(píng)估骨靶向多肽與 TBC在體外的親和性，以及骨靶向多肽/TBC支架中骨靶向多肽的緩釋性能。
　　方法：
　　1.制備煅

3、燒牛松質(zhì)骨，60Co輻照滅菌，通過(guò)X射線光電子能譜（XRD）、傅立葉紅外光譜儀(FTIR)、掃描電鏡(SEM)對(duì)其進(jìn)行表征，分析物相和形貌以及微孔孔徑大小、孔隙率。
　　2.將TBC支架材料（0.5cm×0.5cm×0.5cm）為吸附的主要介質(zhì)，將其與100ug/ml多肽、骨靶向多肽及rhBMP-2溶液充分作用10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min，BCA（Bicinc

4、honininc acid assay）法測(cè)定上清液中多肽、骨靶向多肽及rhBMP-2的濃度，繪制吸附曲線。
　　3.以TBC支架材料（0.5cm×0.5cm×0.5cm）為吸附的主要介質(zhì)，將其與100ug/ml具有熒光標(biāo)記的多肽、骨靶向多肽及rhBMP-2溶液充分作用120min后，取出后避光于冷凍干燥機(jī)中，12小時(shí)后取出在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
　　4.將0.5cm×0.5cm×0.5cm骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC

5、、rhBMP-2/TBC支架材料分別置于無(wú)菌凍存管中，加入2ml無(wú)菌PBS溶液，置于37℃恒溫?fù)u床上持續(xù)振搖。分別在振搖1d，2d，3d，4d，5d，6d，7d，8d，9d，10d，12d，14d，17d，21d，28d后檢測(cè)釋放液中骨靶向多肽、多肽和rhBMP2含量，計(jì)算均值并繪制累計(jì)釋放曲線。
　　結(jié)果：
　　1.TBC主要成分為HA，表面孔隙大小主要分布在220～650μm之間，孔隙率為84.4±0.3％，力學(xué)強(qiáng)度檢測(cè)

6、，其極限載荷為65N,極限壓強(qiáng)為2.6Mpa。
　　2.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)骨靶向多肽在TBC表面吸附較多，顯著高于多肽和rhBMP-2組。吸附曲線提示：多肽、骨靶向多肽及rhBMP-2在30min內(nèi)均能快速地與TBC進(jìn)行吸附，其中多肽和rhBMP-2達(dá)到吸收的峰值。靶向多肽隨著時(shí)間仍呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在120min時(shí)達(dá)到頂峰。
　　3.緩釋曲線提示：與多肽與rhBMP-2相比，骨靶向多肽復(fù)合TBC后的釋放時(shí)間延長(zhǎng)。
　　

7、結(jié)論：高溫煅燒的TBC支架保留了天然骨的基本理化特性，具有良好的骨傳導(dǎo)性；骨靶向多肽與TBC支架親和性較強(qiáng)，骨靶向多肽復(fù)合TBC后的釋放具有緩釋效果。
　　第三部分、骨靶向多肽/TBC支架生物相容性和骨誘導(dǎo)活性研究
　　目的：研究骨靶向多肽/TBC支架的生物相容性，評(píng)估骨靶向多肽/TBC支架的安全性和骨誘導(dǎo)活性，為其體內(nèi)應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.骨靶向多肽/TBC與無(wú)血清培養(yǎng)基比例為0.2g/ml，密封

8、混合于37℃恒溫箱中，浸提24小時(shí)后制備浸提液，使用100%、75%、50%、25%的浸提液、培養(yǎng)基（陰性對(duì)照組）和0.64%苯酚溶液（陽(yáng)性對(duì)照組）與L929細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞相對(duì)增值率。
　　2.取成年SD大鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組，每組各10只，麻醉成功后將0.5cm×0.5cm×0.5cm骨靶向多肽/TBC支架植入皮下組織，術(shù)后觀察大鼠一般情況，術(shù)后將支架及其周圍組

9、織完整取出，行HE染色觀察。
　　3.將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/ml濃度均勻接種于靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rhBMP-2/TBC支架材料表面，培養(yǎng)5天后通過(guò)SEM觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并利用MTT法測(cè)定支架表面細(xì)胞的ALP活性。
　　4.取SPF級(jí)昆明小鼠8只，雌雄各半，隨機(jī)分為骨靶向多肽/TBC組、多肽/TBC組、rhBMP-2/TBC組、TBC組，每組各2只，麻醉成功后，分別將支架材料植入小鼠股四頭肌肌間隙

10、中，術(shù)后觀察一般情況，4周時(shí)取材，HE染色觀察支架材料周圍的新骨形成情況。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：各浸提液組中的L929細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，無(wú)細(xì)胞毒性，細(xì)胞相對(duì)增值率與陰性對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，細(xì)胞毒性分級(jí)為I級(jí)。
　　2.骨靶向多肽/TBC支架植入大鼠皮下12周后的亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在大體觀察上未發(fā)現(xiàn)差異，HE染色也未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死。
　　3.SEM觀察發(fā)現(xiàn)，MC3T

11、3-E1細(xì)胞在骨靶向多肽/TBC、rhBMP-2/TBC支架材料表面生長(zhǎng)較好，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形和多角形，細(xì)胞數(shù)量較多，連接成片，ALP活性也明顯高于多肽/TBC支架材料組和TBC組。
　　4.HE染色提示：TBC組中，在材料周圍主要是纖維結(jié)締組織；在骨靶向多肽/TBC支架材料組中，材料中間有大量的新骨形成；在rhBMP-2/TBC支架材料組中，在材料與肌肉接觸的邊緣可見(jiàn)較多的新骨形成。
　　結(jié)論：骨靶向多肽/TBC支架材料無(wú)細(xì)胞

12、毒性，細(xì)胞在其表面生長(zhǎng)良好，具有良好的生物相容性，在肌間隙內(nèi)具有良好的骨誘導(dǎo)活性。
　　第四部分、骨靶向多肽/TBC支架修復(fù)大鼠顱骨缺損研究
　　目的：探討大鼠顱骨缺損模型建立的相關(guān)影響因素，研究骨靶向多肽/TBC支架材料修復(fù)顱骨缺損的可行性和療效。
　　方法：
　　1.游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠顱骨雙側(cè)頂骨的前后徑和橫徑。
　　2.取成年雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為5mm缺損組（40只）和8mm缺損組（10只），其

13、中5mm缺損組根據(jù)是否屏蔽硬腦膜和骨膜，隨機(jī)分為四組：硬腦膜屏蔽組、骨膜屏蔽組、硬腦膜和骨膜均屏蔽組、未處理組。術(shù)后8周和12周取材，通過(guò)影像學(xué)和組織學(xué)對(duì)其骨修復(fù)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　3.在大鼠顱骨缺損模型中，將骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rhBMP-2/TBC、TBC支架材料分別植入缺損處，術(shù)后4周和8周取材，行影像學(xué)和組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠顱骨頂骨前后徑為7.44±0.42mm；左右徑為5.13

14、±0.12mm。
　　2.大鼠顱骨缺損（雙側(cè)，CSD為5mm）在術(shù)后8周和12周Micro-CT檢測(cè)提示：硬腦膜和骨膜均屏蔽組中，新生骨形成最少，體積百分比（BV/TV×100%）在分別為10.6±3.4%，17.4±5.7%；在未處理組中，缺損修復(fù)較好，新骨形成體積百分比為61.6±7.4%，90.6±4.1%。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，在硬腦膜和骨膜均屏蔽組中，缺損處有大量的纖維結(jié)締組織，骨長(zhǎng)入較少；而未處理組中大量新生骨組織生成。<

15、br>　　3.大鼠顱骨缺損模型中，雙側(cè)5mm和8mm（中央側(cè)）在硬腦膜和骨膜均屏蔽時(shí)，術(shù)后8周和12周新生骨形成百分比相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在術(shù)中出血量、手術(shù)時(shí)間和死亡率方面，8mm組顯著高于5mm組。
　　4.術(shù)后4周和8周Micro-CT檢測(cè)提示：rhBMP-2/TBC組和骨靶向多肽/TBC中新生骨體積百分比無(wú)顯著差異，均高于多肽/TBC組，而TBC組中的新生骨體積百分比最少。
　　5.術(shù)后4周和8周HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，TBC

16、組中骨組織長(zhǎng)入較少，在多肽/TBC、骨靶向多肽/TBC、rhBMP-2/TBC組中，骨組織長(zhǎng)入較多，其中靶向多肽/TBC組中在材料周圍和缺損邊緣可見(jiàn)大量的新生骨組織。
　　6.術(shù)后免疫組化染色：4周時(shí)TBC組成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)最弱，多肽組、骨靶向多肽組、rhBMP-2組成骨相關(guān)蛋白表達(dá)依次增強(qiáng)；8周時(shí)，TBC組ALP表達(dá)增強(qiáng)，而多肽組、骨靶向多肽組及rhBMP-2組均有不同程度降低；各組OCN表達(dá)均增強(qiáng)，其中骨靶向多肽組與rhBM

17、P-2組OCN表達(dá)最高。
　　結(jié)論：大鼠顱骨缺損模型中，當(dāng)硬腦膜和骨膜均屏蔽時(shí)，雙側(cè)5mm缺損在自我修復(fù)能力方面與8mm無(wú)明顯差異，而且并發(fā)癥較少，適合作為一個(gè)骨缺損模型。骨靶向多肽/TBC可以促進(jìn)大鼠顱骨缺損的修復(fù)，是一種較理想的皮質(zhì)骨缺損修復(fù)支架材料。
　　第五部分、骨靶向多肽/TBC支架修復(fù)兔股骨髁骨缺損研究
　　目的：探討骨靶向多肽/TBC支架修復(fù)兔股骨髁骨缺損研究的可行性與療效。
　　方法：取成年雄性新

18、西蘭大白兔20只，麻醉成功后，在兔股骨髁外側(cè)利用環(huán)鉆鉆取直徑6mm、高10mm的松質(zhì)骨骨缺損模型，隨機(jī)分別植入TBC、骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rhBMP-2/TBC支架材料，每組10只。術(shù)后觀察動(dòng)物一般情況，4周和8周時(shí)取出，將雙側(cè)股骨髁完整取出，行影像學(xué)檢查和組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果：
　　1.術(shù)后4周和8周Micro-CT掃描提示：rhBMP-2/TBC組和骨靶向多肽/TBC中新生骨體積百分比無(wú)顯著差異，均高于多

19、肽/TBC組，而TBC組中的新生骨體積百分比最少。
　　2.HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，TBC中支架材料周圍可見(jiàn)少量骨組織長(zhǎng)入，在骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rhBMP-2/TBC中，骨組織長(zhǎng)入較多。在靶向多肽/TBC、rhBMP-2/TBC組中，材料周圍可見(jiàn)少量板狀骨和血管長(zhǎng)入，在材料與宿主交界處可見(jiàn)大量新生骨組織。Lane-Sandhu評(píng)分中，rhBMP-2/TBC組與靶向多肽/TBC組無(wú)明顯差異，顯著高于多肽/TBC組，TBC組