濃香型白酒窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)分析及其對(duì)原酒風(fēng)味物質(zhì)的影響.pdf

1、濃香型白酒以固態(tài)窖泥發(fā)酵為特征，窖泥中微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要影響。目前關(guān)于窖泥環(huán)境中復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成影響的研究鮮有報(bào)道。本研究以河南省宋河酒業(yè)股份有限公司不同窖齡的窖底泥為研究對(duì)象，通過(guò)傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)獲得不同窖齡窖泥可培養(yǎng)的好氧和厭氧細(xì)菌；基于16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)研究在窖泥老熟過(guò)程中整體原核微生物的群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析不同窖齡窖池原酒

2、及不同菌株發(fā)酵液的風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成，進(jìn)而在窖泥微生物與原酒風(fēng)味物質(zhì)之間建立聯(lián)系，為改善窖泥質(zhì)量、提高白酒品質(zhì)等提供了理論依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，分離純化了不同窖齡窖泥中的好氧和厭氧細(xì)菌，并對(duì)分離菌株采用16S rRNA基因序列分析進(jìn)行初步鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，分離得到的45株好氧細(xì)菌屬于9個(gè)不同的種，分別為米氏解硫胺素芽孢桿菌（Aneurinibacillus migulanus）、枯草

3、芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、菠茨坦短芽孢桿菌（Brevibacillus borstelensis）、地衣芽孢桿菌（Ba. licheniformis）、側(cè)孢短芽孢桿菌（Br. laterosporus）、短小芽孢桿菌（Ba. pumilus）、Paenibacullus lautus、耐寒短桿菌（Brevibacterium frigoritolerans）、P. cellulositrophicus，其中波茨坦短

4、芽孢桿菌、米氏解硫胺素芽孢桿菌和P. lautus等鮮見(jiàn)研究報(bào)道。隨著窖齡的增長(zhǎng)，窖底泥可培養(yǎng)好氧芽孢桿菌的數(shù)量逐漸減少。⑵采用RCM和ES兩種培養(yǎng)基對(duì)窖泥中的厭氧梭菌屬（Clostridium）進(jìn)行分離篩選并進(jìn)行16SrRNA序列分析。結(jié)果表明，分離得到的100株厭氧菌株中，除少數(shù)菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）以外，其余78株分別與GenBank中8種梭菌屬（Clostridium）細(xì)菌的序列同源性>91%的分別為C. cel

5、erecrescens、C. carboxidivorans、C. cochlearium、C. sporogenes、C. sartagoforme、C. thermopalmarium、C. aurantibutyricum、C. butyricum。分布于10年窖池窖泥樣品中可培養(yǎng)梭菌種類(lèi)與6年和1年窖齡窖泥樣品有所不同，主要原因可能是窖泥的理化性質(zhì)隨著窖齡的增加呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而促使其中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)地改變。⑶通過(guò)高通量

6、測(cè)序技術(shù)，對(duì)宋河酒廠(chǎng)不同窖齡（1年、6年、10年）窖泥中的原核微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明，隨著窖齡的增長(zhǎng)，原核微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化，尤其是不同窖齡中的主要微生物屬的變化尤其顯著。隨著窖齡的增長(zhǎng)，厚壁菌門(mén)中的乳酸菌（Lactobacillus）和喜熱菌屬（Caloramator）的相對(duì)豐度呈減小趨勢(shì)，與1年窖齡相比，10年窖齡窖泥中乳酸菌和喜熱菌屬的相對(duì)豐度分別減少了5.73倍和6.17倍。但是，厚壁菌門(mén)中的其它

7、屬的相對(duì)豐度在1年窖齡窖泥中普遍偏低，如梭菌屬（Clostridium）、互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas）、Sedimentibacter、Unclassified Clostridia等。10年窖齡和1年窖齡相比，廣古菌門(mén)中的甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和短桿菌屬(Methanobrevibacter)的相對(duì)豐度分別增加了5.31、3.26和3.99倍。隨著

8、窖齡的增長(zhǎng)，互養(yǎng)菌門(mén)門(mén)下的Aminobacterium和放線(xiàn)菌門(mén)門(mén)下Unclassfied_Coriobacteriaceae的相對(duì)豐度具有相同的增長(zhǎng)趨勢(shì)。從1年窖齡到6年窖齡，擬桿菌門(mén)門(mén)中的Unclassfied_Porphyromonadaceae、 Blvii28和Unclassfied_BA008相對(duì)豐度呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但在10年窖齡中又逐漸降低了。綠彎菌門(mén)下的T78從1年窖齡中的相對(duì)豐度為0.82%增長(zhǎng)到6年窖齡中的3.43%，到

9、10年窖齡時(shí)又降到0.21%。其次，冗余分析（RDA）表明pH、NH4+、有效磷（AP）、有效鉀（AK）、和 Ca2+等環(huán)境因子對(duì)原核微生物的群落結(jié)構(gòu)有顯著性的影響。⑷采用液液萃取和GC—MS對(duì)宋河酒廠(chǎng)1年、6年和10年窖齡原酒中的香味物質(zhì)進(jìn)行分析；采用頂空固相微萃取和GC—MS對(duì)菌株發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，并與原酒中的香味物質(zhì)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，分離的好氧與厭氧菌株均可產(chǎn)生多種濃香型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)或其前體物質(zhì)。好氧菌株O2.4（

10、Bacillus subtilis）、O2.10（Bacillus licheniformis）、O2.11（Brevibacillus laterosporus）、O2.15（Bacillus pumilus）、O2.17（Paenibacillus lautus）、O2.18（Bre. frigoritolerans）、O2.19（Paenibacillus cellulositrophicus）的菌株發(fā)酵液中含有較高比例的己酸乙酯