來自嗜熱子囊菌的耐熱重組木聚糖酶在巴斯德畢赤酵母中的異源表達(dá).pdf

1、目的：通過在巴斯德畢赤酵母中異源表達(dá)進(jìn)一步提高嗜熱子囊菌木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
　　方法：基于巴斯德畢赤酵母的密碼子使用偏倚優(yōu)化原嗜熱子囊菌木聚糖酶基因xynA的基因序列。構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGAPZαA-xynA、pPIC9K-xynA，經(jīng)線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主畢赤酵母 GS115中，構(gòu)建重組菌株。經(jīng)過含博萊霉素（zeocin）的YPD瓊脂板初篩后，抽提基因組篩選陽性轉(zhuǎn)化子。使用博來霉素濃度梯度YPD瓊脂平板復(fù)篩轉(zhuǎn)化子。采用硫

2、酸銨沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換柱層析、分子篩層析等方法分離、純化重組木聚糖酶。通過SDS-PAGE凝膠電泳和酶譜實(shí)驗(yàn)確定重組木聚糖酶大小，利用高碘酸硝酸銀染色和Endo H酶處理檢測重組酶是否為糖蛋白及糖蛋白的類型。以失活的重組木聚糖酶 XynA作對照，與重組木聚糖酶XynA同樣在Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中42°C處理激光打印紙72h，檢測其脫墨效果。在Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中高溫（70~80°C）酶解未處理

3、的玉米芯，溫育36h后測定其糖化效果。
　　結(jié)果：密碼子優(yōu)化后的 xynA基因通過設(shè)計(jì)、合成，并且在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)。篩選出在木聚糖瓊脂板中形成最大水解透明圈的菌株RX8，用于搖瓶發(fā)酵，并產(chǎn)生40U/ml的木聚糖酶活性。S-75型葡聚糖凝膠層析純化后的重組木聚糖酶比酶活最高，達(dá)到1053U/mg的木聚糖活性。通過SDS-PAGE凝膠電泳和酶譜實(shí)驗(yàn)確定重組木聚糖酶大小為75kDa。高碘酸-硝酸銀染色法顯示該重組木聚糖酶為糖蛋白，

4、其表觀分子量顯著高于其蛋白理論值，表明該重組木聚糖酶在表達(dá)的過程中發(fā)生了高度糖基化。重組木聚糖酶 XynA的最適反應(yīng)條件為75°C和pH8.0。該酶在100°C下保溫8h仍保持高于80%的酶活性。重組木聚糖酶在Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中42°C處理激光打印紙72h的脫墨效果（247%）高于報(bào)道的芽孢桿菌木聚糖酶CKBx1D（200％）。其在高溫酶解過程（70~80°C）中對未處理的玉米芯保溫36h后的糖化效率7.44%。此外