達(dá)氏鰉熱休克蛋白70和90基因的克隆及其對溫鹽脅迫的響應(yīng).pdf

1、分類號分類號密級密級UDC編號編號碩士學(xué)位論文達(dá)氏鰉熱休克蛋白70和90基因的克隆及其對溫鹽脅迫的響應(yīng)彭國干(1261003)指導(dǎo)教師姓名趙文教授專業(yè)名稱生態(tài)學(xué)論文答辯日期2015年5月25日學(xué)位授予日期2015年6月摘要I摘要達(dá)氏鰉自然種群是生活于我國黑龍江及其流域的冷水性淡水魚，屬于鱘科魚類，其個體大，抗病力強(qiáng)，性成熟晚，養(yǎng)殖目的主要是獲取魚子醬。目前，達(dá)氏鰉養(yǎng)殖群體已從寒冷的黑龍江南移至北京、河北、湖北、四川、重慶、云南等地，養(yǎng)殖

2、溫度逐漸升高，運輸頻率逐漸變大，達(dá)氏鰉面臨著越來越嚴(yán)峻的生存考驗。熱休克蛋白（HSP）是生物體中重要的應(yīng)激蛋白，它對保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有突出的作用。本文的主要目的是研究熱休克蛋白在幫助達(dá)氏鰉應(yīng)對嚴(yán)峻環(huán)境挑戰(zhàn)時做出的調(diào)控方式，以期為達(dá)氏鰉在養(yǎng)殖和運輸方面提供理論支持，旨在為保護(hù)達(dá)氏鰉人工種群提供理論依據(jù)。本文采用同源克隆法和末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆了達(dá)氏鰉HSP70和HSP90基因全長序列，并設(shè)計5個溫度梯度（4℃、10℃、1

3、6℃、25℃、28℃）和5個鹽度梯度（0ppt、10ppt、20ppt、30ppt、40ppt）的條件對達(dá)氏鰉進(jìn)行處理，以溫度16℃鹽度0ppt作為對照，做組織表達(dá)差異分析，同時取肌肉、鰓絲和肝臟作為樣品做熒光定量分析。試驗結(jié)果得出，達(dá)氏鰉HSP70基因（Genbank登錄號：KP050541）序列全長為2275bp，包括5′非編碼區(qū)85個核苷酸，3′非編碼區(qū)237個核苷酸和開放閱讀框（F）1953個核苷酸。通過分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，達(dá)氏

4、鰉HSP70基因編碼氨基酸650個，分子量71.13KD，理論等電點5.215，含有HSP70家族的3個標(biāo)簽序列，分別位于氨基酸序列的9－16（IDLGTTYS），197－210（IFDLGGGTFDVSIL）和334－348（IVLVGGSTRIPKIQK）上。達(dá)氏鰉HSP90基因（Genbank登錄號：KP050542）序列全長2718bp，包括5′非編碼區(qū)44bp，3′非編碼區(qū)497bp和開放閱讀框（F）2178bp。通過分析氨基

5、酸序列發(fā)現(xiàn)，達(dá)氏鰉HSP90編碼725個氨基酸，分子量83.62KD，其理論等電點4.846。該蛋白含有HSP90家族的1個標(biāo)簽序列，位于氨基酸序列的32－41（YSNKEIFLRE）上。達(dá)氏鰉熱休克蛋白組織表達(dá)分析顯示，HSP70和HSP90在達(dá)氏鰉的11種組織中都有表達(dá)，包括肌肉、鰓絲、腦、須、心臟、肝臟、脾臟、胃、腸道、鰾和性腺，其中兩個基因在腸道中的表達(dá)量均最高，在肌肉中的表達(dá)量均最低，同時我們發(fā)現(xiàn)HSP70和HSP90在各組織

6、間的表達(dá)趨勢是一致的。溫度脅迫表達(dá)分析結(jié)果顯示，4℃處理下在肌肉，鰓絲和肝臟中達(dá)氏鰉HSP70和HSP90的表達(dá)量均是最高；相對于高溫脅迫（25℃、28℃），達(dá)氏鰉HSP70和HSP90對低溫脅迫（4℃、10℃）更敏感。鹽度脅迫表達(dá)分析結(jié)果顯示，各鹽度脅迫下，達(dá)氏鰉HSP70和HSP90基因表達(dá)量變化不大。本研究結(jié)果分析表明，達(dá)氏鰉熱休克蛋白在4℃情況下高表達(dá)，說明HSP70和HSP90基因在伴隨達(dá)氏鰉度過嚴(yán)寒的環(huán)境發(fā)揮了非常重要的作用