miR-11靶向Ras85D基因調控黑腹果蠅蛹體長大小的研究.pdf

1、變態(tài)發(fā)育是昆蟲發(fā)育中最具特色和最為重要的現(xiàn)象，也是昆蟲對外界環(huán)境長期適應進化的結果。根據(jù)發(fā)育過程中是否存在蛹期把昆蟲分為完全變態(tài)與不完全變態(tài)兩大類。完全變態(tài)昆蟲被認為是昆蟲綱中進化程度最高的一群，其一生要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個階段。通常完全變態(tài)昆蟲的成蟲形態(tài)和大小是由蛹個體長度大小來決定的。然而，哪些因素影響了昆蟲蛹體長度的大小呢？已有的研究發(fā)現(xiàn)蛹體長度大小的形成涉及一系列的基因表達、網(wǎng)絡調控和激素調節(jié)，其發(fā)育調控機制極其復雜。目前

2、，人們對于這一機制的了解還只是冰山一角，特別是miRNA如何調控昆蟲蛹期發(fā)育更是知之甚少。miRNA是一類21～24nt的非編碼小RNA，其通過調控靶基因的轉錄后表達水平發(fā)揮生物學功能。由于成熟miRNA的片段較短以及靶基因眾多等特點導致目前對miRNA確切的和多樣化的功能研究較為困難，因此利用生物信息學和分子生物學實驗相結合方法對miRNA調控昆蟲蛹體長度大小進行深入研究，不僅對深刻揭示miRNA在昆蟲變態(tài)發(fā)育中的調控機制具有重要的理

3、論意義，而且對農業(yè)昆蟲的防治也具有重要的實踐價值。
　　黑腹果蠅是完全變態(tài)昆蟲同時也是經(jīng)典的模式生物，因此本論文選取黑腹果蠅為研究對象，對miRNA調控黑腹果蠅的蛹體長度大小進行研究。分析黑腹果蠅miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-11在三齡幼蟲后期到預蛹期均出現(xiàn)表達量的增加，而在其它階段表達量較低。進一步對miR-11所屬家族進化分析發(fā)現(xiàn)miR-11只在完全變態(tài)昆蟲中保守，而不完全變態(tài)昆蟲中沒有發(fā)現(xiàn)miR-11的存在，這些結果暗示m

4、iR-11可能參與了黑腹果蠅蛹期發(fā)育調控。為了驗證這一假設，論文進行了以下研究:
　　1.利用RMCE技術和Gal4/UAS系統(tǒng)構建了miR-11的敲除或缺失品系以及miR-11的過表達品系，并且對miR-11突變品系進行表型觀察，發(fā)現(xiàn)miR-11的敲除或功能性缺失突變體品系會導致黑腹果蠅蛹體長度和重量均變大，而miR-11全身過表達品系則出現(xiàn)蛹期致死。對一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、蛹和成蟲五個不同發(fā)育階段表型觀察及體長測量排除

5、了發(fā)育延遲導致蛹變長的可能，同時發(fā)現(xiàn)miR-11的敲除會導致蛹和雌雄成蟲的體長均出現(xiàn)增長，而幼蟲期的miR-11敲除品系與野生型相比沒有顯著性差異。敲除或者抑制miR-11活性能夠使黑腹果蠅在變態(tài)過程中形成體長較大的蛹，暗示miR-11可能參與了黑腹果蠅蛹體長度大小的調控。
　　2.為了揭示miR-11調控黑腹果蠅的蛹體長大小的機制，利用生物信息學技術對miR-11的189個靶基因進行信號通路富集性分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要涉及Ra

6、s/MAPK信號通路，并且miR-11能夠靶向Ras/MAPK通路中的Ras85D和Sos基因。進一步對miR-11與Ras85D、Sos基因的靶標關系進行體內和體外驗證，發(fā)現(xiàn)miR-11能夠作用Ras85D基因的3'UTR區(qū)域，而無法靶向Sos基因的3'UTR區(qū)域，表明miR-11可能是通過靶向Ras85D基因來調控蛹體長度大小。
　　3.為了證明是否miR-11直接靶向Ras85D來調控蛹體長度大小的形成，對靶基因Ras85D

7、在miR-11誘導的蛹缺陷表型中的作用進行了研究。我們運用基礎遺傳學方法構建雙突變體:同時敲除miR-11和抑制的Ras85D的功能品系，發(fā)現(xiàn)雙突變株能夠挽救了miR-11敲除株的表型缺陷。對Ras85D和miR-11的時間表達模式分析，發(fā)現(xiàn)m iR-11和Ras85D的表達量在化蛹以后的呈現(xiàn)此消彼長表達模式。這些結果表明miR-11在整個變態(tài)發(fā)育過程中抑制Ras85D的表達，并且通過直接靶向Ras85D調控蛹體長度大小的形成。

8、　　綜上所述，我們利用生物信息學結合分子生物學實驗的有效手段，證明了黑腹果蠅miR-11可以通過直接靶向Ras85D的3'UTR進而調控蛹體長度大小的形成，最終參與了蛹期變態(tài)發(fā)育的調控。論文結果為miRNA調控昆蟲變態(tài)發(fā)育提供了有力的和切實的實驗證據(jù);為深入揭示昆蟲變態(tài)發(fā)育的調控機制提供了新視角和有益的啟示;生物信息學和分子生物學技術相結合的手段能有效地發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因和功能，這為進一步研究miRNA的潛在功能提供了新的研究策略;