兩種蜘蛛的毒素基因克隆和表達.pdf

1、研究背景:
　　 當前，對蜘蛛毒素的生物功能及其作為藥物先導分子在藥理學研究中應用的探索，越來越受到天然藥物開發(fā)研究者的重視。但是，天然毒液的產(chǎn)量較小這一問題，一直制約著其功能和活性的研究進展。為此，探索合成或者生產(chǎn)蜘蛛毒素的簡便易行的方法，已經(jīng)是當前該領域研究者亟待解決的問題。虎紋捕鳥蛛（Ornithoctonus huwena）是分布在華南山區(qū)的一種體型較大的毒蜘蛛。目前已從其毒液中分離出多種蛋白質(zhì)和多肽，并且已經(jīng)鑒定部分蛋

2、白質(zhì)和多肽的生物活性。其中，多肽DkTx(double-knot toxin)可以通過刺激細胞膜外側(cè)孔區(qū)域激活辣椒素受體和瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）通道，促進降鈣素相關肽的釋放，進而起到舒血管及降血壓的作用。森林漏斗蛛(Agelena silvatica)是漏斗蛛科蜘蛛中，毒液毒性較小的蜘蛛，廣泛分布在我國南北方的山林和草原地區(qū)，其可利用毒液麻痹昆蟲進行捕食。目前，國內(nèi)尚沒有對該種蜘蛛的毒素研究，缺乏相關的數(shù)據(jù)，本研究將填補

3、這些數(shù)據(jù)的空白。
　　 研究目的:
　　 1、篩選DkTx的類似物，并進行功能分析。
　　 2、構(gòu)建森林漏斗蛛毒腺的cDNA文庫，篩選新的毒素基因。
　　 研究方法:
　　 1、設計引物，在虎紋捕鳥蛛毒腺cDNA文庫中，通過PCR擴增出目的基因。將目的基因構(gòu)建至表達載體pVT102U/α，利用釀酒酵母S-78株進行表達，并將表達產(chǎn)物分離純化、鑒定。
　　 2、取森林漏斗蛛毒腺，利用Crea

4、torTM SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit構(gòu)建cDNA文庫，設計引物，通過PCR擴增篩選新的毒素基因。
　　 研究結(jié)果
　　 1、在虎紋捕鳥蛛毒腺的cDNA文庫中，成功篩選出4種DkTx類似物: FR+T3F34+P-5、 FR+T3F34+P-6、 FR+T5R32+P-8、FR+T5R32+P-105。并通過釀酒酵母S-78株表達了DkTx類似物，其中FR+T5R32+P-8

5、的氨基酸序列得以正確表達。
　　 2、通過構(gòu)建cDNA文庫，篩選出5種cDNA序列:D7、D82、D134、D523、D787。其中D7、D134、D523、D787為新的蜘蛛毒素基因;D82與Agelenopsis aperta的蜘蛛毒素Toxin_7超家族的序列完全相同。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功篩選了4種DkTx的類似物，并通過釀酒酵母表達。
　　 2、通過構(gòu)建森林漏斗蛛cDNA文庫，成功克隆出