黃河鯉卵巢發(fā)育抑制性消減雜交文庫的構(gòu)建和相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及功能分析.pdf

1、生物在其生命周期中，基因按時(shí)間和空間的順序有序地進(jìn)行表達(dá)，從而也決定了生命活動(dòng)的多樣性和復(fù)雜性。在魚類性腺發(fā)育過程中，基因的時(shí)空表達(dá)方式也受到嚴(yán)格而精確的調(diào)控，不同的發(fā)育階段，其表達(dá)基因各不相同。通過比較卵巢不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)差異，即可能尋找到與卵巢發(fā)育密切相關(guān)的基因，因此，本文選取黃河鯉不同發(fā)育時(shí)期的卵巢進(jìn)行差異基因研究。本研究從mRNA水平上，分別以未分化性腺和二期卵巢為驗(yàn)證方(Tester)，以成魚卵巢為驅(qū)動(dòng)方(Driver)

2、，構(gòu)建抑制性消減雜交文庫;利用Sorthern斑點(diǎn)雜交篩選后測(cè)序得到文庫中的序列。借助GO信號(hào)通路分析其功能，從中選取與卵巢發(fā)育相關(guān)的候選基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR驗(yàn)證其表達(dá)。進(jìn)而挑選Bmp基因進(jìn)行詳細(xì)研究，結(jié)合已有的黃河鯉轉(zhuǎn)錄組文庫驗(yàn)證得到Bmp家族12個(gè)基因的cDNA序列，通過qRT-PCR分析其表達(dá)情況，挑選Bmp2、Bmp4和Bmp15進(jìn)行深入研究。借助鯉魚基因組信息對(duì)Bmp2、Bmp4和Bmp15所在染色體的基因結(jié)構(gòu)

3、、染色體同線性分析，通過組織原位雜交和免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)其進(jìn)行時(shí)空表達(dá)定位;利用Bmp信號(hào)通路抑制劑DSM體外處理性腺，初步探究Bmp信號(hào)通路對(duì)黃河鯉性別分化和早期卵巢發(fā)育的作用。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴成功構(gòu)建黃河鯉魚未分化性腺和二期卵巢的抑制性消減雜交文庫，經(jīng)過轉(zhuǎn)化搖菌，兩個(gè)文庫一共得到約1200個(gè)單克隆，用巢式PCR進(jìn)行初步篩選，得到約600個(gè)含有插入片段的陽性克隆;之后借助Sorthern斑點(diǎn)雜交，進(jìn)一步驗(yàn)證選出差

4、異顯著的150個(gè)克隆送公司測(cè)序。⑵測(cè)序得到的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在Genebank中進(jìn)行Blast比對(duì)，除去重復(fù)和一些微衛(wèi)星序列，兩個(gè)庫共得到78個(gè)unigene。GO分析文庫基因的生物信號(hào)通路，分類分屬17類，其中較多基因ESTs序列分屬于蛋白質(zhì)水解作用，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)等。結(jié)合其基因功能分析和相關(guān)研究，選取與卵巢發(fā)育相關(guān)的22個(gè)候選基因（Bmp2，Pvalb, Midlip1l,Pax2，Zgc，Desmin，Bmp

5、4等）進(jìn)行文庫驗(yàn)證，并對(duì)其功能進(jìn)行初步分析。⑶選取可能參與卵巢發(fā)育的Bmp家族基因，在黃河鯉魚未分化性腺、幼魚和成魚雌雄性腺中對(duì)其表達(dá)模式定量分析，發(fā)現(xiàn)Bmp2、Bmp4和Bmp15分別在二期卵巢、未分化性腺和成熟卵巢中有高表達(dá)，故挑選Bmp2、Bmp4和Bmp15進(jìn)行深入研究，驗(yàn)證得出Bmp2、Bmp4和Bmp15分別為2068、2037、2165的全長(zhǎng)序列，各編碼410、399和384個(gè)氨基酸，且羧基端均含有TGF-β結(jié)構(gòu)域。分析基

6、因Bmp4基因在基因組骨架上有一個(gè)重復(fù)出現(xiàn)，且其同線性分析染色體位置和其他物種差異較大。Bmp2和Bmp15分別位于黃河鯉第40號(hào)染色體和第5號(hào)染色體，同線性分析展示了和斑馬魚高度的進(jìn)化相似性。⑷原位雜交和免疫組化定位發(fā)現(xiàn)Bmp2、Bmp4和Bmp15三個(gè)基因表達(dá)位置相似，在二期卵巢中均集中在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，成熟卵巢時(shí)期集中表達(dá)在卵泡周圍的皮質(zhì)小泡中，結(jié)合其表達(dá)量推測(cè)Bmp2是黃河鯉卵巢早期發(fā)育的重要調(diào)控基因;Bmp15基因則作為卵泡早期

7、生長(zhǎng)調(diào)控基因可能參與黃河鯉卵巢中卵泡大小的發(fā)育。⑸黃河鯉魚未分化性腺中Bmp信號(hào)通路受到DSM成功抑制后，三個(gè)雄性標(biāo)志基因(Amh，Dmrt1，Sox9a)在高濃度或者高劑量時(shí)出現(xiàn)顯著或極顯著表達(dá)上調(diào)，雌性基因Cyp19和Foxl2表達(dá)量顯著降低，性腺在分子水平上出現(xiàn)偏向雄性分化的趨勢(shì)，說明Bmp信號(hào)通路對(duì)于未分化性腺向雌雄分化起重要調(diào)節(jié)作用;對(duì)二期卵巢處理后也顯示出抑制卵巢發(fā)育，故推測(cè)Bmp信號(hào)通路對(duì)于維持雌性卵巢早期正常發(fā)育有著重要