枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶的純化及酶學性質的研究.pdf

1、彈性蛋白酶是一種以水解不溶性彈性硬蛋白為特征的廣譜蛋白水解酶?？梢杂蓜游镆扰K提取，也可以由微生物發(fā)酵生產。由于其廣譜的蛋白水解活性，不僅在醫(yī)療上有其應用價值，而且在食品、日用化工品工業(yè)上也有著廣闊的應用前景和較高的商業(yè)價值。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件基礎上，本實驗應用柱層析和凝膠電泳分離純化了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)彈性蛋白酶，研究了該酶的酶學性質，并探討了枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶、胰彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶對常見肉類蛋白質的

2、降解作用及嫩化效果。主要結論如下： 1.發(fā)酵液經過硫酸銨分段鹽析、透析和SephadexG-100凝膠過濾柱層析，得到兩個洗脫峰，將兩個波峰產物分別收集濃縮，經活性檢測發(fā)現(xiàn)波峰二有較高的彈性蛋白酶酶解活性。SDS-PAGE結果表明：該產物是分子量約30KDa的單一條帶。此外，1mmol/L濃度的Ca2+在酶的純化過程中起到較好的穩(wěn)定酶活的作用，而關于Ca2+應用于彈性蛋白酶的純化方法的研究，國內外文獻還未見報道。 2

3、.枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適作用溫度為50℃，且能耐受高溫，將此酶于60℃處理4h后，酶活僅下降了35％。該酶在pH8～11之間酶活力趨于穩(wěn)定，但在pH5時出現(xiàn)一個拐點；同時，在不同類型緩沖液中，酶的最適pH值不同：在硼砂-硼酸緩沖體系中為pH7.4，在Tris-HCl緩沖體系中為pH8.6。0.3mmol/LNa+對酶活有微弱的激活作用；3mmol/L的Ca2+和Zn2+對酶活有明顯的促進作用，且Ca2+效果更顯著；Li+、K+、B

4、a2+、Mg2+和Mn2+對酶活均有不同程度的抑制作用，金屬離子濃度越高，抑制作用越強；在酶反應系統(tǒng)中，添加金屬離子鰲合劑EDTA，它對酶活的抑制作用隨濃度的增加而加強，當EDTA達到50mmol/L時，對酶活有顯著的抑制作用，酶活僅為原有的17％。 3.對枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶酶促水解條件進行了探討，不同酶濃度下酶解動力學過程發(fā)生了明顯改變，高酶濃度下可以顯著提高彈性蛋白的降解率；不同底物添加量的水解過程也有所不同，過高或過

5、低底物添加量都不利于彈性蛋白的水解。該彈性蛋白酶的米氏常數(shù)Km為0.0057g/ml，最大反應速度Vmax為0.0308U/ml，催化動力學方程為：V=0.0308[S]/0.0057+[S]。 4.枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶、胰彈性蛋白酶可以不同程度的降解彈性蛋白、干酪素、明膠和牛血清白蛋白。木瓜蛋白酶也能夠降解除彈性蛋白以外的其他蛋白質。同時，通過比較以上三種酶對富含彈性蛋白的牛肉、牛肚、牛筋、豬肉和豬皮五種肉類蛋白質的水解情