枯草芽孢桿菌BE-91菌株木聚糖酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)和免疫原性研究.pdf

1、本研究旨在優(yōu)化枯草芽孢桿菌BE-91菌株木聚糖酶活力測(cè)定體系，提高酶活力測(cè)定方法的靈敏度和準(zhǔn)確性；建立一套高效、快速分離純化方法，獲得電泳純木聚糖酶樣品；獲得一套較全面的木聚糖酶酶學(xué)參數(shù)，測(cè)定和分析蛋白質(zhì)氨基酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及與其他種屬木聚糖酶的親緣關(guān)系；探索木聚糖酶的免疫原性，為枯草芽孢桿菌BE-91菌株木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 1．采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌BE-91菌株木聚糖酶活力測(cè)定條件

2、進(jìn)行系統(tǒng)研究，獲得優(yōu)化的木聚糖酶活力測(cè)定條件為：按1/9的比值添加稀釋100倍的木聚糖酶與預(yù)熱至62℃的濃度為0.8％的木聚糖底物（用pH值5.4～5.6、0.05 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配制），62℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)3min，加入2.0mL DNS溶液，沸水浴顯色10min，測(cè)定波長(zhǎng)為540nm。在此優(yōu)化條件下，測(cè)得枯草芽孢桿菌BE-91菌株木聚糖酶活力達(dá)350.24U·mL-1。
　　 2．對(duì)枯草芽孢桿菌BE-9

3、1菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)超聲波破碎法證實(shí)木聚糖酶主要集中在胞外，測(cè)得發(fā)酵液酶活408U·mL-1。采用超濾和葡聚糖凝膠層析從發(fā)酵液中分離純化出電泳純木聚糖酶樣品，回收率高達(dá)69.17％，純化倍數(shù)18倍，比酶活達(dá)到28453.6U·mg-1。
　　 3．利用純化的BE-91木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，采用SDS-PAGE和凝膠層析測(cè)得分子量分別為22.54kD、22.31kD;IEF-PAGE測(cè)得等電點(diǎn)為9.63;以燕麥木聚糖為底物

4、時(shí)，Km值和Vmax分別為0.5mg·mL-1、533U;穩(wěn)定溫度0-60℃；穩(wěn)定pH4.6～6.4；Fe2+、C02+有激活作用，Cu2+有強(qiáng)烈抑制作用。
　　 4．對(duì)枯草芽孢桿菌BE-91菌株木聚糖酶電泳純樣品進(jìn)行ESI-MS/MS測(cè)序，得到5個(gè)肽段信息：YNAPSIDGDR、TTFTQYWSVR、SDGGTYDIYTTTR、RPTGSNATITFSNHVNAWK、SPLIEYYVVDSWGTYRPTGTYK、經(jīng)NCBI-B

5、lastp和NCBI-Clustalx比對(duì)推測(cè)出木聚糖酶的氨基酸全序列，與劉正初在Genebank登錄的木聚糖酶基因(登錄號(hào)為EU233656）的氨基酸序列一致。通過(guò)生物信息學(xué)軟件DNAstar-Protean分析BE-91菌株木聚糖酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該木聚糖酶屬分泌型、水溶性、跨膜蛋白；假定包括有2～4個(gè)α-螺旋，12～14個(gè)β-折疊，18個(gè)β-轉(zhuǎn)角，1個(gè)的疏水結(jié)構(gòu)域，8個(gè)親水結(jié)構(gòu)域，4～8個(gè)抗原決定簇；對(duì)全序列進(jìn)行GENOME比

6、對(duì)，建立系統(tǒng)演化關(guān)系，結(jié)果顯示與芽孢桿菌親緣關(guān)系較近，且比較保守。
　　 5．利用純化的BE-91菌株木聚糖酶免疫SPF小鼠，收集血清樣品，以建立的ELISA方法檢測(cè)血清樣品中IgG水平、INF-Υ和IL-4含量，利用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組IgG水平OD450nm=0.2159，與陰性組、空白組有極顯著性差異（P<0.01），空白組與陰性組無(wú)顯著性差異（P>0.05）；試驗(yàn)組INF-Υ含量26.47pg·m

7、L-1，與陰性組、空白組和陽(yáng)性組有極顯著性差異（P<0．Ol），陽(yáng)性組與陰性組、空白組有極顯著性差異（P<0.01），空白組與陰性組無(wú)顯著性差異（P>0.05）；試驗(yàn)組IL-4含量52.53pg·mL-l，與陽(yáng)性組無(wú)顯著性差異（P>0.05），與陰性組、空白組有極顯著差異(P<0.01)，空白組與陰性組無(wú)顯著性差異（P>0.05）。Western Blot驗(yàn)證出清晰的目的條帶，證明獲得的多克隆抗體是針對(duì)枯草芽孢桿菌BE-91菌株木聚糖酶