旋毛蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的克隆表達(dá)及鑒定.pdf

1、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase，GST）是一種具有解毒功能的酶，對(duì)各種有害的外源性化合物（如致癌物質(zhì)和誘變劑）與細(xì)胞內(nèi)源性化合物（如脂質(zhì)過(guò)氧化合物）均有分解功能。GST在寄生蟲的抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，它可以除去大部分的外源性和內(nèi)源性的親電子化合物，有助于寄生蟲在宿主內(nèi)的生存。GST蛋白酶在一些寄生蟲中已被鑒定并有所研究，如犬惡絲蟲、馬來(lái)絲蟲、日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、肝片吸蟲及豬帶絳蟲等，

2、但關(guān)于旋毛蟲GST的研究目前尚未見報(bào)道。
　　本研究利用生物信息學(xué)分析了 TsGST與其它寄生蟲及模式生物 GST的進(jìn)化關(guān)系，應(yīng)用分子克隆基因技術(shù)表達(dá)并純化了一種旋毛蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶TsGST，獲得rTsGST蛋白及其免疫血清。通過(guò)SDS-PAGE和Western blot分析了該重組蛋白的抗原性及免疫原性，RT-PCR、Western blot及免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定了TsGST基因在旋毛蟲不同發(fā)育蟲期的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及其在蟲體

3、的定位；觀察了rTsGST免疫小鼠后的抗體應(yīng)答類型及對(duì)宿主的免疫保護(hù)作用、免疫血清對(duì)旋毛蟲侵入腸上皮細(xì)胞（IEC）的影響及免疫血清介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)旋毛蟲的殺傷作用（ADCC）。運(yùn)用生物化學(xué)方法分析了rTsGST的酶活性及其最佳反應(yīng)條件。本研究鑒定了rTsGST的性質(zhì)及其功能，為闡明旋毛蟲的侵入、生存及其與宿主小腸上皮細(xì)胞的相互作用和致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法:
　　1.旋毛蟲蟲種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系
　　旋毛蟲（

4、Trichinella spiralis）由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室昆明小鼠傳代保種。BALB/c小鼠、4-6周齡，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所用細(xì)胞系為小鼠腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC），是由本教研室分離培養(yǎng)。
　　2. rTsGST的免疫學(xué)分析
　　將rTsGST免疫BALB/c小鼠，獲得rTsGST免疫血清，應(yīng)用旋毛蟲感染小鼠血清及rTsGST通過(guò)ELISA及Weste

5、rn blot鑒定rTsGST的抗原性。
　　3. TsGST基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及定位
　　收集旋毛蟲的感染性幼蟲、成蟲、新生幼蟲及肌幼蟲，提取總 RNA進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增TsGST基因及內(nèi)參基因GAPDH，檢測(cè)TsGST基因的表達(dá)時(shí)相。收集小鼠感染旋毛蟲后3d與7d的成蟲，新生幼蟲及肌幼蟲，制備可溶性抗原進(jìn)行Western blot，用rTsGST免疫血清對(duì)不同蟲期的可溶性抗原進(jìn)行識(shí)別，檢測(cè)TsGST蛋白在不同蟲期是否有

6、表達(dá)。
　　收集旋毛蟲感染性幼蟲、3d與7d成蟲、新生幼蟲及肌幼蟲，IFA檢測(cè)rTsGST免疫血清與旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期蟲體的反應(yīng)性，觀察TsGST蛋白在蟲體的定位。將收集的不同期蟲體進(jìn)行石蠟包埋組織切片，通過(guò)IFA觀察TsGST蛋白在不同時(shí)期蟲體的具體定位。
　　4. rTsGST蛋白的免疫保護(hù)性分析
　　將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組（每組20只）：分別為rTsGST蛋白免疫組、佐劑及PBS對(duì)照組。按20μg蛋

7、白/只小鼠的劑量進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每隔10 d免疫1次，共3次，末次免疫后10 d，每只小鼠經(jīng)口攻擊感染300條旋毛蟲肌幼蟲。攻擊感染后7d每組各剖殺10只小鼠，回收腸道期成蟲并計(jì)算成蟲減蟲率，剩余小鼠感染后42 d剖殺，收集肌幼蟲并計(jì)算肌幼蟲減蟲率。同時(shí)收集小鼠免疫后不同時(shí)間血清，利用ELISA分析rTsGST蛋白免疫小鼠所引起的免疫反應(yīng)類型。
　　5. rTsGST免疫血清對(duì)旋毛蟲侵入IEC的影響及ADCC作用
　　為了

8、觀察rTsGST免疫血清體外對(duì)旋毛蟲侵入IEC的影響，將rTsGST免疫血清、感染后42 d小鼠血清及正常小鼠血清分別與半固體培養(yǎng)基按1:10混合，加入感染性幼蟲，覆蓋到IEC細(xì)胞表面，37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)2 h，觀察幼蟲侵入 IEC細(xì)胞的情況，計(jì)算侵入率。將旋毛蟲肌幼蟲與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，并加入不同濃度的重組蛋白免疫血清（1:5、1:50、1:100、1:200及1:500），37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至30h，

9、觀察肌幼蟲存活的情況，計(jì)算死亡率，觀察rTsGST免疫血清介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒作用（ADCC）。
　　6. TsGST與寄生蟲及模式生物GST的進(jìn)化關(guān)系分析
　　在GenBank搜索并保存其它生物GST的氨基酸序列，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，構(gòu)建進(jìn)化樹遵從最佳簡(jiǎn)約原則，根據(jù)進(jìn)化樹分析TsGST與其他物種的進(jìn)化關(guān)系。選取旋毛蟲屬中的本土旋毛蟲（T. nativa）和偽旋毛蟲（T. pseudospiralis）以及血

10、吸蟲屬中的曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的GST氨基酸序列，利用Clustal W軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行氨基酸序列的相似性分析。
　　7. rTsGST的酶活性及其性質(zhì)分析
　　GST具有催化還原性谷胱甘肽GSH與2，4二硝基苯CDNB結(jié)合的能力，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰值波長(zhǎng)為340nm，通過(guò)測(cè)定340nm處吸光度上升速率，計(jì)算出GST的酶活力。rTsGST酶在不同溫度和不同pH值的反應(yīng)條件下，觀察該酶反應(yīng)的最佳溫度和pH值，以及金屬離

11、子與其他試劑對(duì)酶活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1. ELISA結(jié)果顯示，rTsGST免疫血清與旋毛蟲可溶抗原產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)；Western blot發(fā)現(xiàn)，抗rTsGST血清可識(shí)別旋毛蟲可溶性抗原及純化的rTsGST，均在24 kDa處顯示明顯條帶，表明rTsGST具有較強(qiáng)的抗原性，且TsGST是旋毛蟲可溶性抗原的組分。
　　2. RT-PCR分析結(jié)果表明，TsGST基因在旋毛蟲感染性幼蟲、成蟲、新生幼蟲和肌幼蟲4個(gè)時(shí)期均

12、有表達(dá)；Western blot顯示TsGST蛋白在旋毛蟲各個(gè)蟲期都有表達(dá)。IFA結(jié)果顯示，rTsGST免疫血清能夠與旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期的蟲體發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)（顯現(xiàn)黃綠色熒光）；蟲體組織切片IFA結(jié)果顯示TsGST主要位于蟲體的皮層、桿狀體和生殖原基部位。
　　3. rTsGST蛋白免疫小鼠后可以產(chǎn)生抗TsGST的高滴度抗體，誘導(dǎo)產(chǎn)生了以Th2免疫反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)（表現(xiàn)為高水平的IgG1)。旋毛蟲攻擊感染后， rTsGST免疫小鼠的

13、成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為35.71%和38.55%。
　　4. rTsGST免疫血清體外對(duì)旋毛蟲侵入 IEC具有明顯的抑制作用，rTsGST免疫血清、感染血清及正常血清3組的幼蟲侵入率分別31.0%,11.36%及78.96%（χ2=46.4，P<0.05）。ADCC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫血清組的蟲體死亡率70%，明顯高于正常血清組的12%（χ2=69.048,P<0.001），蟲體死亡率具有抗體劑量依賴性（χ2=173.332,P<

14、0.001）。
　　5.進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，TsGST與旋毛蟲屬中的本土旋毛蟲和偽旋毛蟲 GST的進(jìn)化最近，與人類GST的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果顯示， TsGST氨基酸序列與本土旋毛蟲、偽旋毛蟲、曼氏血吸蟲及日本血吸蟲的 GST氨基酸序列的相似度分別為60%、65%、31%、30%。
　　6. rTsGST生化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，純化后的rTsGST蛋白具有GST酶活性，最適反應(yīng)條件是溫度為40℃，pH6.3–7.

15、2。H2O2可完全抑制酶的活性，Mn2+和Na+離子可部分抑制酶的活性， Ca2+、Mg2+和K+離子對(duì)GST酶活性無(wú)明顯影響，但Ni2+離子可將酶活性增加54.7%。
　　結(jié)論:
　　1.重組的TsGST蛋白具有良好的抗原性及GST的酶活性；
　　2. TsGST在旋毛蟲不同發(fā)育期均有轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，主要定位在蟲體的皮層、桿狀體和生殖原基；
　　3. rTsGST免疫血清在體外對(duì)旋毛蟲侵入 IEC具有明顯的抑制作用