家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe3基因的克隆和真核表達(dá).pdf

1、家蠶既是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是重要的模式生物。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一類由多基因編碼的多功能同工酶超家族，廣泛分布在動(dòng)物、植物、酵母和細(xì)菌等生物體中，該酶系在解毒內(nèi)源和外源性有毒物質(zhì)中起著重要作用[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，越來越多的有機(jī)農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，但是伴隨而來的是昆蟲的抗性也隨之加強(qiáng)。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，研究家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制，對(duì)于闡明谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與殺蟲劑抗性的關(guān)系，

2、防治農(nóng)林害蟲有著重要的理論意義，本文采用生物信息學(xué)分析方法，依據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息，預(yù)測(cè)劍家蠶的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因BmGSTe3，采1用RT-PCR方法分析了其組織表達(dá)特性并進(jìn)行了序列分析。利用基因工程技術(shù)，克隆谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶后，通過桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建真核表達(dá)載體，對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基岡進(jìn)行了外源表達(dá)，初步建立和探索出了一條在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白的路線。 1.BmGSTe3

3、基因的克隆和序列分析克隆了家蠶的BmGSTe3基因，該基因的完整編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為651bp，由5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子組成，且所有的外顯子/內(nèi)含子拼接邊界均符合典型的GT-AG規(guī)則，外顯子總長(zhǎng)度為512bp，每個(gè)外顯子長(zhǎng)度都不超過250bp。內(nèi)含子總長(zhǎng)度為4792bp，其中第一內(nèi)含子最長(zhǎng)，為1771bp，第二內(nèi)含子最短，為7SSbp。BmGSTe3包含N-末端和C-末端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N-末端由β-α-β-α-β-β-α共7個(gè)結(jié)構(gòu)基序組成，而

4、C-末端則由5個(gè)僅螺旋構(gòu)成，有一個(gè)保守的Ser催化位點(diǎn)以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)BmGSTe3有1個(gè)TATA盒，在上游2500bp區(qū)域內(nèi)搜尋相關(guān)調(diào)控元件時(shí)，共發(fā)現(xiàn)了15個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，分別是：XRE(1)、ARE(4)、TRE(5)和NF-kB(5)。系統(tǒng)發(fā)生樹明顯分為四人類群，分別是Dlata、Epsilon、Theta和Zeta四大類。而家蠶BmGSTe3與昆蟲特異的Epsilon家族聚為一類。 2.BmGSTe3基

5、因組織表達(dá)特性BmGSTe3表達(dá)模式分析表明，BmGSTe3基因只有血淋巴和頭部有表達(dá)，在其余6個(gè)組織中不表達(dá)，并且在頭中表達(dá)量較血淋巴中高。表明BmGSTe3基因的表達(dá)具有較高的組織特異性。 3.重組轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒載體的構(gòu)建與鑒定利用基因重組技術(shù)將重組克隆質(zhì)粒PMD18-T/BmGSTe3和轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA進(jìn)行了桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建，得到了重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA-BmGSTe3。將重組的轉(zhuǎn)移載體p

6、FastBacHTA-BmGSTe3轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，獲得了含有BmGSTe3基因的重組病毒Bac-BmGSTe3。 4.BmGSTe3基因的真核表達(dá)運(yùn)用cellfectinm轉(zhuǎn)染試劑將重組病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入sf9細(xì)胞后，經(jīng)SDS-PAGE分析鑒定，比較蛋白條帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染重組桿狀病毒Bacmid-BmGSTe3的細(xì)胞有一約為28KD左右的目的特異蛋白條帶表達(dá)。 5.GSTs酶活性測(cè)定以CDNB作底物，對(duì)重組表達(dá)蛋