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文檔簡介
1、目的:研究1.25二羥維生素 D3(1,25-dihydroxyvitamin D3)對人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移的影響,并探討1,25(OH)2D3對 HepG2細(xì)胞生物學(xué)影響的可能機(jī)制。
方法:(1)MTT法檢測10-8、10-7、10-6mol/L1,25(OH)2D3以及2.5、5、10、20、40、80μmol/L LY294002對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響;10-7mol/L1,25(OH)2D3
2、聯(lián)合5μmol/L LY294002對 HepG2細(xì)胞增殖的影響, compusyn軟件計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)。(2)根據(jù) MTT的結(jié)果將實(shí)驗(yàn)分為四組:對照組,1,25(OH)2D3組(10-7mol/L),LY294002組(5μmol/L),聯(lián)合組(10-7mol/L1,25(OH)2D3+5μmol/L LY294002),對照組與各藥物對肝癌HepG2細(xì)胞均處理72小時(shí)。(3)Tanswell小
3、室檢測各組對HepG2細(xì)胞侵襲的影響。(4)劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測各組對 HepG2細(xì)胞遷移能力的抑制作用。(5)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組對HepG2細(xì)胞克隆形成能力的影響。(6)Western blot檢測各組PCNA、MMP-9、p-AKT、PTEN蛋白的表達(dá)情況。(7)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(Real-time PCR)檢測各組PTEN、 AKT基因mRNA相對表達(dá)量。
結(jié)果:(1)1,25(OH)2D3以及LY294002對人
4、肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)(P<0.05);10-7mol/L1,25(OH)2D3聯(lián)合5μmol/L LY294002對細(xì)胞增殖抑制顯著,且二者聯(lián)合高于單獨(dú)藥物組( P<0.05), compusyn軟件計(jì)算CI=0.728<1,二者具有協(xié)同效應(yīng)。(2)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1,25(OH)2D3組、LY294002組以及聯(lián)合組對肝癌 HepG2細(xì)胞的侵襲能力均有抑制作用,細(xì)胞侵襲數(shù)分別為45.9±6.4、49.9±
5、6.0、27.8±4.0,與對照組(64.6±8.0)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1,25(OH)2D3組、LY294002組以及聯(lián)合組,對人肝癌HepG2遷移能力均有抑制作用,且48h遷移距離分別為35.57±4.83、37.43±3.89、25.77±3.11,與對照組(62.33±3.17)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;72h遷移距離分別為46.63±3.35、43.70±5.96、28.60±2.98,
6、與對照組(89.80±4.70)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各藥物組對單個(gè)細(xì)胞增殖有抑制作用,1,25(OH)2D3組、LY294002組以及聯(lián)合組集落形成數(shù)分別為95.00±13.12、82.33±7.51、48.00±4.36,與對照組(134.00±16.09)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)Western blot分析1,25(OH)2D3組、聯(lián)合組作用72h后PTEN蛋白表達(dá)量增加,與對照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意
7、義(P<0.05),LY294002作用組PTEN蛋白表達(dá)量與對照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,1,25(OH)2D3組、LY294002組以及聯(lián)合組作用72h后,PCNA、MMP-9、p-AKT蛋白的表達(dá)量均降低,與對照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且聯(lián)合用藥組蛋白表達(dá)量低于單獨(dú)1,25(OH)2D3、LY294002用藥組蛋白表達(dá)量(P<0.05)。(6)Real-time PCR結(jié)果顯示1,25(OH)2D3組PTENmRNA、聯(lián)
8、合組PTENmRNA與正常對照組PTENmRNA相比較,相對表達(dá)量升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LY294002組PTENmRNA與正常對照組PTENmRNA相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1,25(OH)2D3組AKTmRNA、LY294002組AKTmRNA以及聯(lián)合組AKTmRNA與正常對照組AKTmRNA相比,相對表達(dá)量變化差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:1,25(OH)2D3可顯著抑制人肝癌
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