絨山羊—牛異種核移植胚胎的構(gòu)建及其組蛋白乙?；揎椀难芯?pdf

1、隨著核移植技術(shù)的不斷發(fā)展,異種核移植的研究成為新的熱點(diǎn)。異種核移植突破了物種之間的生殖隔離限制,對(duì)物種的改良、瀕危動(dòng)物的保護(hù)具有十分重要的意義。但目前無(wú)論同種還是異種,核移植的效率都很低。有研究表明,供體核的不完全重編程,導(dǎo)致在發(fā)育過(guò)程中有重要作用的基因沒(méi)有表達(dá)或異常表達(dá),是克隆效率低的主要原因。表觀遺傳修飾的異常是核移植胚胎重編程異常的主要原因,其中基因組DNA甲基化和組蛋白修飾是重要的表觀遺傳修飾,二者在調(diào)控染色體重構(gòu)、基因表達(dá)中起

2、著重要作用。目前,較多的研究集中在重構(gòu)胚發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化的重編程,而有關(guān)組蛋白乙酰化的研究并不多。為了提高核移植效率,深入研究組蛋白乙?；揎棇?duì)核移植胚胎重編程的影響,本研究以成年絨山羊耳皮膚成纖維細(xì)胞為核供體,以牛卵母細(xì)胞為核受體構(gòu)建異種重構(gòu)胚,對(duì)融合條件、激活條件以及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,并研究了絨山羊-牛異種重構(gòu)胚在原核形成過(guò)程中組蛋白H3、H4乙?；揎椖Ｊ?進(jìn)一步比較了同種核移植胚胎與異種核移植胚胎在原核形成過(guò)程中組蛋白乙

3、?；揎椀牟町?。此外,使用組蛋白去乙?；敢种苿?duì)卵母細(xì)胞和異種重構(gòu)胚進(jìn)行處理,探討了藥物處理對(duì)重構(gòu)胚早期發(fā)育的影響。 1、絨山羊-牛異種核移植體系的建立本研究建立了成年絨山羊耳皮膚成纖維細(xì)胞系,對(duì)其體外生長(zhǎng)特性及核型進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,成年絨山羊耳皮膚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中具有正常的細(xì)胞形態(tài)、分裂增殖特性以及染色體數(shù)目。本研究以體外培養(yǎng)的成年絨山羊耳皮膚成纖維細(xì)胞為核供體,以去核牛卵母細(xì)胞為受體構(gòu)建異種重構(gòu)胚。在核移植操

4、作后不同恢復(fù)時(shí)期(0.5hr、1.0hr、>1.0hr)進(jìn)行融合；并通過(guò)改變電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖時(shí)程、脈沖次數(shù)等融合參數(shù),探討了不同處理組合(電場(chǎng)強(qiáng)度180v/mm、脈沖時(shí)程20μs、脈沖1次；電場(chǎng)強(qiáng)度180v/mm、脈沖時(shí)程20μs、脈沖2次；電場(chǎng)強(qiáng)度190v/mm、脈沖時(shí)程20μs、脈沖2次；電場(chǎng)強(qiáng)度190v/mm、脈沖時(shí)程30μs、脈沖2次)對(duì)融合效率的影響；同時(shí)還比較了不同激活劑(7％乙醇聯(lián)合6-DMAP;A23187聯(lián)合6-DMAP

5、;Ionomycin聯(lián)合6-DMAP)對(duì)重構(gòu)胚激活效果的影響。結(jié)果表明,在當(dāng)前的核移植系統(tǒng)中,核移植完成后恢復(fù)0.5hr融合,明顯提高了重構(gòu)胚的融合率；使用電場(chǎng)強(qiáng)度為190v/mm,脈沖時(shí)長(zhǎng)為20μs,2次脈沖的融合條件,可以獲得較好的融合效果；使用A23187聯(lián)合6-DMAP的激活條件能夠獲得較高的卵裂率和8-細(xì)胞率。另外,本研究還對(duì)體外培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示,采用SOFaa、M199和CR1aa三種發(fā)育液?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)時(shí),異種重構(gòu)胚

6、均可發(fā)育到桑椹胚階段,且8-細(xì)胞重構(gòu)胚以及桑椹胚的發(fā)育率均無(wú)顯著差異。但綜合卵裂率、8-細(xì)胞發(fā)育率以及桑椹胚發(fā)育率來(lái)看,CR1aa培養(yǎng)液更有利于絨山羊-牛異種重構(gòu)胚胎的發(fā)育。當(dāng)采用CR1aa(4％FBS)聯(lián)合牛顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),成功獲得了絨山羊-牛異種核移植囊胚,囊胚率為3.55％,初步建立了絨山羊-牛異種核移植體系。 2、TSA處理對(duì)異種重構(gòu)胚發(fā)育的影響Trichostatin A (TSA)是一種組蛋白去乙?；敢种苿?可以特異地抑

7、制組蛋白去乙?；傅幕钚?增加供體核的組蛋白乙酰化水平,增強(qiáng)基因表達(dá)。本研究使用TSA處理卵母細(xì)胞或重構(gòu)胚,探討了藥物處理對(duì)異種重構(gòu)胚早期發(fā)育的影響。結(jié)果表明,使用含1ng/ml TSA的成熟液體外成熟培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞18hr,然后用于核移植,可顯著提高桑囊率(18.26％ vs 8.62％,P<0.05),但是卵裂率及8-細(xì)胞發(fā)育率沒(méi)有顯著差異(P>0.05);分別使用不同濃度TSA(1ng/ml、10ng/ml)處理異種重構(gòu)胚4hr(

8、從激活時(shí)算起),發(fā)現(xiàn)各試驗(yàn)組(1ng/ml、10ng/ml)與對(duì)照組在8-細(xì)胞率及桑囊率上均無(wú)顯著差異(P>0.05),僅在卵裂率上,1ng/mlTSA處理組與10ng/ml TSA處理組存在極顯著的差異(66.67％vs 50.60％,P<0.01);使用1ng/ml TSA分別處理異種重構(gòu)胚4hr和24hr,各處理組(4hr、24hr)與對(duì)照組之間在卵裂率及8-細(xì)胞率上均無(wú)顯著差異(P>0.05),但使用TSA處理異種重構(gòu)胚24hr

9、后顯著地降低了桑囊率(4.79％vs 13.68％,P<0.05),說(shuō)明較長(zhǎng)時(shí)間的TSA處理將影響絨山羊-牛核移植重構(gòu)胚的正常發(fā)育。 3、異種重構(gòu)胚1-細(xì)胞期組蛋白乙酰化重編程的研究組蛋白修飾是重要的表觀遺傳修飾,在調(diào)控染色體重構(gòu)、基因表達(dá)中起著重要作用。本研究利用熒光免疫化學(xué)方法檢測(cè)了絨山羊-牛異種核移植胚胎1-細(xì)胞期組蛋白H3K9、H3K18和H4K8乙酰化的動(dòng)態(tài)變化,并與牛同種核移植胚胎在1-細(xì)胞期組蛋白乙?；膭?dòng)態(tài)變化進(jìn)行了比較