牛孤雄胚早期發(fā)育過程中組蛋白乙酰化的調(diào)控作用研究.pdf

1、在哺乳動物中，雄性的繁殖效率遠高于雌性，因而對雄性動物進行選擇的強度大，育種效果好。理論上，用孤雄生殖技術(shù)構(gòu)建的胚胎擁有兩套父源遺傳物質(zhì)，如果胚胎能完成整個發(fā)育過程、直至出生，則可通過引進凍精來實現(xiàn)最優(yōu)種公畜個體的引種和擴繁，實現(xiàn)新品種的培育。然而，由于孤雄胚胎只含有單親基因組，所以胚胎存活力極低，是否存在某些等位印記基因的親緣特異性表達和異常的表觀遺傳修飾問題，尚無定論。本研究比較了牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚在體外培養(yǎng)條件下的發(fā)育率

2、、組蛋白H3和H4乙?；降淖兓?guī)律、發(fā)育相關(guān)基因的表達情況，進一步利用組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砼９滦叟撸^察其對胚胎發(fā)育率的影響、分析處理后胚胎中組蛋白H3和H4乙?；胶湍遗哔|(zhì)量的變化情況，以探討牛孤雄胚早期發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控機制，為開發(fā)提高牛孤雄胚早期發(fā)育率的新方法奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.牛孤雄胚早期發(fā)育能力及其與孤雌胚和體外受精胚的比較
　　比較牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚在相同培養(yǎng)體系下發(fā)

3、育至2-細胞、4-細胞、8～16-細胞、桑葚胚和囊胚階段的比率，發(fā)現(xiàn):在2-細胞到囊胚胚階段，孤雄胚的發(fā)育能力顯著低于體外受精胚和孤雌胚，特別是囊胚發(fā)育率，孤雄胚只有7.79±0.97％，顯著低于體外受精胚（36.37±1.17％）和孤雌胚(42.32±0.68％)(p＜0.05)，說明牛孤雄胚的早期體外發(fā)育能力顯著低于體外受精胚和孤雌胚。
　　2.牛孤雄胚早期發(fā)育過程中組蛋白H3和H4乙?；降淖兓?guī)律及其與孤雌胚和體外受精胚

4、的比較
　　應(yīng)用細胞免疫熒光染色的方法，比較牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚在相同培養(yǎng)體系下發(fā)育至2-細胞、4-細胞、8-細胞、16-細胞、桑葚胚和囊胚中的組蛋白H3和H4整體乙?；郊捌渥兓?guī)律，發(fā)現(xiàn):
　　(1)牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚早期發(fā)育過程中組蛋白H3乙酰化水平的變化:在2-細胞和4-細胞階段，牛孤雄胚、體外受精胚和孤雌胚中組蛋白H3的乙?；礁叩拖嗷ケ容^均無顯著差異;在8-細胞階段孤雄胚中組蛋白H3的乙?；?/p>

5、水平與體外受精胚或孤雌胚相比差異不顯著，不過此階段孤雌胚中的組蛋白H3乙?；斤@著高于體外受精胚(p＜0.05);在16-細胞階段孤雄胚中組蛋白H3的乙酰化水平顯著低于體外受精胚(p＜0.05)，但孤雄胚中組蛋白H3的乙酰化水平與孤雌胚相比差異不顯著;在桑葚胚和囊胚階段的孤雄胚中組蛋白H3的乙?；骄@著低于體外受精胚和孤雌胚(p＜0.05)，孤雌胚與體外受精胚中的組蛋白H3的乙?；讲町惥伙@著。在整個早期胚胎體外發(fā)育過程中，孤

6、雄胚、孤雌胚和體外受精胚中組蛋白H3的乙?；阶兓?guī)律均呈先下降后上升的趨勢，孤雄胚和孤雌胚組蛋白H3的乙?；骄?6-細胞階段左右達到最低水平，而體外受精胚組蛋白H3的乙?；皆?-細胞階段左右達到最低水平。
　　(2)牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚早期發(fā)育過程中組蛋白H4乙?；降淖兓?在2-細胞和4-細胞階段，牛孤雄胚、體外受精胚和孤雌胚中組蛋白H4的乙酰化水平高低相互比較也均無顯著差異;在8-細胞階段孤雄胚中組蛋白

7、H4的乙?；斤@著低于體外受精胚和孤雌胚(p＜0.05)，但此階段的孤雌胚和體外受精胚中組蛋白H4乙?；讲町惒伙@著;在16-細胞、桑葚胚和囊胚階段孤雄胚中組蛋白H4的乙酰化水平顯著低于體外受精胚(p＜0.05)，不過孤雄胚中組蛋白H4的乙酰化水平與孤雌胚相比差異不顯著，孤雌胚與體外受精胚相比差異也不顯著。在整個早期胚胎體外發(fā)育過程中，孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚中組蛋白H4的乙酰化水平變化規(guī)律也都呈先下降后上升的趨勢，孤雄胚組蛋白H

8、4的乙?；皆?-細胞階段左右達到最低水平，而孤雌胚和體外受精胚組蛋白H4的乙?；骄?-細胞階段左右達到最低水平。
　　以上研究結(jié)果表明，牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚早期發(fā)育過程中組蛋白H3和H4乙?；匠蕜討B(tài)變化且在3種胚胎之間存在差異;孤雄胚在早期胚胎發(fā)育過程中整體乙?；狡停@可能是導(dǎo)致其發(fā)育效率低下的因素之一。
　　3.牛孤雄生殖囊胚中發(fā)育相關(guān)基因的表達及其與孤雌胚和體外受精胚的比較
　　應(yīng)用熒光

9、定量PCR方法檢測牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚囊胚中發(fā)育潛能基因（OCT4和CDX2）、印記基因(父系印記母源表達基因:H19和IGF2R;母系印記父源表達基因:IGF2和SNRPN)和組蛋白去乙?；{(diào)控基因(HDAC1和HDAC2)的mRNA表達水平的差異，發(fā)現(xiàn):
　　(1)發(fā)育潛能基因的表達:孤雄胚中OCT4基因的mRNA表達水平顯著低于體外受精胚和孤雌胚(p＜0.05)，孤雌胚和體外受精胚中OCT4基因的mRNA表達水平差異

10、不顯著;孤雄胚和體外受精胚中CDX2基因的mRNA表達水平差異不顯著，但孤雄胚中CDX2基因的mRNA表達水平顯著高于孤雌胚(p＜0.05)。
　　(2)印記基因的表達:孤雄胚中父系印記母源表達基因H19和IGF2R的mRNA表達水平均顯著低于體外受精胚(p＜0.05)，相反，孤雌胚中H19和IGF2R基因的mRNA表達水平顯著高于體外受精胚(p＜0.05);孤雄胚的母系印記父源表達基因IGF2的mRNA表達水平顯著高于體外受精胚

11、(p＜0.05)，不過孤雄胚中另一種母系印記父源表達基因SNRPN的mRNA表達水平卻顯著低于體外受精胚(p＜0.05)，孤雌胚中IGF2和SNRPN的mRNA表達水平均顯著低于體外受精胚(p＜0.05)。
　　(3)組蛋白去乙酰化調(diào)控基因的表達:牛孤雄胚中組蛋白去乙?；{(diào)控基因HDAC1和HDAC2的mRNA表達水平均顯著高于體外受精胚的表達量(p＜0.05)，但孤雄胚和孤雌胚中兩基因的表達水平差異不顯著。
　　以上研究結(jié)

12、果表明，牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚囊胚中調(diào)控胚胎發(fā)育的基因存在表達差異，發(fā)育潛能基因、印記基因和組蛋白去乙?；刚{(diào)控基因的異常表達可能與牛孤雄胚早期胚胎發(fā)育能力低下有關(guān)。
　　4組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理對牛孤雄胚發(fā)育效率的影響
　　以牛孤雄胚早期發(fā)育可能存在異常的表觀修飾為起點，應(yīng)用調(diào)控早期胚胎發(fā)育的組蛋白去乙?；敢种苿?TSA和SCR)處理所構(gòu)建的牛孤雄胚，檢測牛孤雄胚不同時期的發(fā)育率，分析其與去乙?；敢种苿舛取?/p>

13、處理時間以及處理方式的關(guān)系，研究結(jié)果如下:
　　(1)抑制劑處理濃度影響胚胎發(fā)育率:分別利用6個濃度的TSA(0、5、10、20、50和100nM/L)或SCR(0、50、100、200、300和500nM/L)在孤雄胚激活后的培養(yǎng)階段處理15h，發(fā)現(xiàn)較低濃度的TSA(5～20nM/L)或SCR（50～200nM/L）能夠顯著改善孤雄胚發(fā)育到8～16細胞、桑椹胚和囊胚的比率(p＜0.05);高濃度的TSA(100nM)或SCR(5

14、00nM)處理孤雄胚不利于其發(fā)育，甚至從2細胞階段開始已經(jīng)影響到胚胎的發(fā)育效率，降低了處理后胚胎的存活率，而且使胚胎發(fā)生胞質(zhì)碎裂的比率顯著上升(p＜0.05)。這表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理孤雄胚后胚胎的發(fā)育能力與抑制劑的處理濃度密切相關(guān)，20nMTSA或200nMSCR是有益于孤雄胚發(fā)育的最適濃度。
　　(2)抑制劑處理時間長短影響胚胎發(fā)育:發(fā)現(xiàn)用20nMTSA在孤雄胚激活后的培養(yǎng)階段分別處理0、10、15、20和25h后，

15、其囊胚發(fā)育比率分別為10.45±0.82％，12.59±1.16％，18.29±1.03％，16.83±0.85％和8.35±1.35％;200nMSCR處理孤雄胚0，10，15，20和25h后，其囊胚發(fā)育比率分別為10.45±0.82％，11.29±0.77％，19.84±1.05％，17.37±1.31％和14.07±1.28％。這說明，孤雄胚的發(fā)育能力與組蛋白去乙?；敢种苿┨幚淼臅r間長短密切相關(guān)，處理時間過短或偏長都不利于孤雄胚

16、發(fā)育，兩種抑制劑處理的最適時間長度均在15～20h。
　　(3)抑制劑處理方式影響胚胎發(fā)育率:用三種方式處理孤雄胚，發(fā)現(xiàn):方案1(在胚胎構(gòu)建后修整期用20nMTSA(或200nMSCR)處理2h+胚胎激活階段4h+培養(yǎng)階段9h)和方案2(胚胎激活期抑制劑處理4h+培養(yǎng)階段11h)處理胚胎后，胚胎發(fā)育至桑椹胚和囊胚階段的比率均低于方案3(胚胎激活后培養(yǎng)階段抑制劑處理15h)。所有用20nMTSA或200nMSCR處理的方案中，胚胎發(fā)

17、育至桑椹胚和囊胚的比率均高于未處理的對照組。這表明，在培養(yǎng)階段開始用蛋白去乙酰化酶抑制劑處理胚胎發(fā)育效果較好。
　　5組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理對牛孤雄生殖囊胚中組蛋白H3和H4乙?；揭约澳遗哔|(zhì)量的影響
　　(1)應(yīng)用細胞免疫熒光染色的方法比較用組蛋白去乙?；敢种苿?20nMTSA或200nMSCR)處理牛孤雄胚后，發(fā)育至囊胚階段胚胎的組蛋白H3和H4整體乙?；降母淖兦闆r。結(jié)果表明，200nMSCR處理孤雄胚后囊胚

18、中的組蛋白H3的整體乙?；斤@著高于未處理的對照組孤雄胚(p＜0.05)，20nMTSA處理組囊胚的H3的整體乙?；揭哺哂趯φ战M;20nMTSA或200nMSCR處理孤雄胚后囊胚中的組蛋白H4的整體乙酰化水平均顯著高于未處理的對照組孤雄胚(p＜0.05)。這說明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑在培養(yǎng)階段處理牛孤雄胚可以提高囊胚階段胚胎的組蛋白H3和H4的整體乙?；?。
　　(2)應(yīng)用囊胚區(qū)分染色的方法比較分析組蛋白去乙?；敢种苿?/p>

19、(20nMTSA或200nMSCR)處理牛孤雄胚后，發(fā)育至囊胚階段胚胎的質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胚胎激活后培養(yǎng)階段用200nMSCR對孤雄胚處理15h左右，發(fā)育至第8天的囊胚總細胞數(shù)、ICM細胞數(shù)、TE細胞數(shù)和ICM/TE比率均顯著高于未處理的對照組胚胎(p＜0.05);而用另一種抑制劑，20nMTSA處理孤雄胚后，其囊胚質(zhì)量也得到改善。這表明組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砉滦叟吣芨纳破淠遗哔|(zhì)量，SCR的處理效果要優(yōu)于TSA。
　　本研究的

20、主要結(jié)論:在相同體外培養(yǎng)體系下，牛孤雄胚的發(fā)育能力顯著低于體外受精胚和孤雌胚;組蛋白H3和H4整體乙酰化水平在這三種胚胎的早期發(fā)育過程中存在差異，且呈動態(tài)變化，孤雄胚在早期胚胎發(fā)育過程中組蛋白整體乙?；脚c體外受精胚和孤雌胚相比較低，這可能是導(dǎo)致其早期體外發(fā)育能力低下的因素之一;此外，影響和調(diào)控牛早期胚胎發(fā)育的基因在牛孤雄、孤雌和體外受精囊胚中的mRNA表達水平存在差異，發(fā)育潛能基因表達缺陷、印記基因和組蛋白去乙?；刚{(diào)控基因的表達異

21、?？赡芘c牛孤雄胚發(fā)育缺陷有關(guān)。利用組蛋白去乙?；敢种苿滦叟咛幚恚艽龠M胚胎發(fā)育，特別是發(fā)育到桑葚胚和囊胚的能力，20nMTSA或200nMSCR是處理孤雄胚的最適濃度，處理較適宜的時間是在胚胎激活后的培養(yǎng)階段，處理適宜時間長度為15h左右;利用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA或SCR處理后得到的囊胚中組蛋白H3和H4整體乙?；缴?，其囊胚質(zhì)量也得到改善，這說明組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理胚胎可以作為體外快速高效構(gòu)建孤雄胚的有效手段之