WNT-β-catenin信號(hào)通路在不同癌癥發(fā)生中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　WNT/β-catenin信號(hào)通路在人類器官和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵效應(yīng)。WNTs是一組能夠編碼分泌型富含半胱氨酸的糖蛋白，其作為信號(hào)分子用于調(diào)節(jié)不同階段的胚胎發(fā)育并參與維持組織穩(wěn)態(tài)。WNT信號(hào)的畸變或異常將導(dǎo)致多種人類疾病，如白血病，先天性四肢切斷癥，精神分裂癥，腎損傷，骨發(fā)病率，肺纖維化和不同種類的癌癥。依據(jù)是否涉及β-catenin，WNT信號(hào)通路可分為典型（WNT/β-catenin途徑）和非典型途徑(WNT/

2、平面細(xì)胞極性(PCP)或WNT/Ca2+途徑）。目前，最廣泛研究的WNT途徑是典型WNT/β-catenin途徑，其在癌癥起始和進(jìn)展中發(fā)揮的作用。在WNT/β-catenin途徑中，WNT配體可以結(jié)合卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)rz）受體激活蓬亂蛋白(DSH)，β-catenin磷酸化被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin積累和核易位，隨后β-catenin作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(LEF1)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合，

3、并激活下游靶基因使之過表達(dá)，如Cyclin D1，c-MYC，PLA2G2A等。TCF/LEF家族是一組通過高遷移率基團(tuán)結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子。WNT/β-catenin信號(hào)通路激活后，其核心參與者β-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并結(jié)合到TCF/LEF家族的成員，可以將共激活因子β-catenin募集到它們所靶向基因的增強(qiáng)子元件中，LEF1和TCF是WNT/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄中樞調(diào)節(jié)劑。到目前為止，接近50％的人類已

4、知腫瘤顯示都與WNT/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)異常有關(guān)。
　　甲狀腺癌(TC)是最常見的內(nèi)分泌器官的惡性腫瘤，大多數(shù)國(guó)家的死亡率為男性0.2～0.4/100，000，女性0.2～0.6/100，000。乳頭狀甲狀腺癌(PTC)是TC最常見的腫瘤亞型，至少占TC的70～80％。由于診斷技術(shù)的提高，大多數(shù)國(guó)家在過去幾十年中TC（主要是PTC）的發(fā)病率呈上升勢(shì)頭。2014年，在美國(guó)大約有63000例新發(fā)的TC被確診。從197

5、5年到2009年，每年的TC發(fā)病率從每100，000人4.9增加到每100，000人14.3，PTC的發(fā)病率從每100，000人3.4增加到每100，000人12.5。因此PTC發(fā)病率的迅速增加在這一變化中發(fā)揮重要的推動(dòng)作用。到2019年，研究預(yù)測(cè)PTC發(fā)病率將增加一倍。這既會(huì)給身體健康帶來嚴(yán)重影響，又會(huì)給家庭、社會(huì)和國(guó)家?guī)砹她嫶蟮慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　胃癌(GC)是一種常見的惡性腫瘤，大約占全球侵襲性腫瘤的10％。在中國(guó)，GC的致死

6、率占癌癥死亡原因的第二位。盡管有報(bào)告提出進(jìn)展期胃癌(AGC)的5年總體生存率在15％～52％之間而早期胃癌(EGC)的5年總體生存率在88％～97％之間，早期發(fā)現(xiàn)、檢測(cè)和治療可以顯著降低死亡率。目前，大范圍的人口變化和環(huán)境污染日益加重伴隨GC確診病例和死亡的數(shù)量大量增加。研究已證實(shí)GC發(fā)病率與環(huán)境污染呈正相關(guān)性。
　　研究方法與結(jié)果:
　　本文旨在研究WNT/β-catenin信號(hào)通路在PTC和GC發(fā)生中的作用，主要包括以下

7、研究?jī)?nèi)容:
　　1.WNT/β-catenin信號(hào)通路在PTC發(fā)生中的作用。
　　1.1運(yùn)用人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片V2.0來比較5組PTC組織和鄰近正常組織。
　　研究方法:為了研究和探索參與PTC發(fā)生的分子機(jī)制，運(yùn)用人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片V2.0來比較5組PTC組織與鄰近正常組織，篩選出1.5倍上調(diào)或下調(diào)基因表達(dá)。運(yùn)用QRT-PCR和Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證WNT10A，CCND1，RXRG

8、，LEF1，MYC，CTNNB1，TPM3在PTC與鄰近正常組織的mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異。
　　研究結(jié)果:使用DAVID分析，六個(gè)基因(CCND1，RXRG，LEF1，MYC，CTNNB1，TPM3，WNT10A)被發(fā)現(xiàn)上調(diào)超過1.5倍在PTC中。WNT10A是WNT配體中唯一表達(dá)上調(diào)超過1.5倍并其表達(dá)上調(diào)超出4倍。QRT-PCR和Western blot分別驗(yàn)證WNT10A，CCND1，RXRG，LEF1，MYC，CTN

9、NB1，TPM3在PTC組織中表達(dá)上調(diào)，與DNA微陣列芯片結(jié)果完全吻合。WNT10A/β-catenin信號(hào)通路在PTC中被激活。
　　1.2 WNT10A/β-catenin信號(hào)通路的激活對(duì)PTC細(xì)胞增殖的影響。
　　研究方法:給予PTC細(xì)胞(K1)不用濃度WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒，通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不用濃度WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒與細(xì)胞增殖能力之間是否存在劑量效應(yīng);隨后給予K1細(xì)胞WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒、干擾RNA

10、WNT10A、LEF1過表達(dá)質(zhì)粒、干擾RNALEF1轉(zhuǎn)染，通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、QRT-PCR和Western blot檢測(cè)并明確WNT10A/β-catenin信號(hào)通路對(duì)K1細(xì)胞增殖的影響。
　　研究結(jié)果:CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果回示W(wǎng)NT10A/β-catenin信號(hào)通路對(duì)K1細(xì)胞增殖作用隨WNT10A質(zhì)粒濃度增加而增強(qiáng)，存在劑量效應(yīng)依賴。隨后實(shí)驗(yàn)過程中，分別給予K1細(xì)胞WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒、WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒+干擾RNAL

11、EF1、LEF1過表達(dá)質(zhì)粒、LEF1過表達(dá)質(zhì)粒+干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染，CCK8結(jié)果顯示:WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒與LEF1過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)K1細(xì)胞增殖能力有顯著增強(qiáng)效應(yīng)，干擾RNALEF1與干擾RNAWNT10A加入后其增殖能力下降。其次QRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒與LEF1過表達(dá)質(zhì)粒作用于K1細(xì)胞時(shí)，WNT10A，CCND1，LEF1，MYC，CTNNB1在mRNA與蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào);加

12、入干擾RNA LEF1與干擾RNAWNT10A作用于K1細(xì)胞時(shí)，WNT10A，CCND1，LEF1，MYC，CTNNB1在mRNA與蛋白水平表達(dá)明顯下降。
　　1.3 WNT10A/β-catenin信號(hào)通路的激活對(duì)PTC細(xì)胞晚期凋亡的影響。
　　研究方法:通過流式細(xì)胞儀分別測(cè)定K1細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡，K1細(xì)胞分別給予WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒、WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒+干擾RNALEF1、LEF1過表達(dá)質(zhì)粒、LEF1過表達(dá)質(zhì)粒+

13、干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染。
　　研究結(jié)果:細(xì)胞凋亡與WNT10A和LEF1有密切相關(guān)性。結(jié)果表明WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒與LEF1過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染于K1細(xì)胞都會(huì)引起晚期凋亡細(xì)胞的比例下降;干擾RNALEF1和干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染于K1細(xì)胞則引起晚期凋亡細(xì)胞比例升高。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果回示:干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞后導(dǎo)致大量細(xì)胞靜息于細(xì)胞周期S期。
　　1.4激活WNT10A/β-catenin信號(hào)通路對(duì)PTC

14、細(xì)胞遷移能力的影響。
　　研究方法:通過傷口愈合實(shí)驗(yàn)分別監(jiān)測(cè)給予WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒、WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒+干擾RNALEF1、LEF1過表達(dá)質(zhì)粒、LEF1過表達(dá)質(zhì)粒+干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染后K1細(xì)胞的遷移能力如何變化。
　　研究結(jié)果:在0h～72h之內(nèi)，WNT10A過表達(dá)質(zhì)粒與LEF1過表達(dá)質(zhì)粒增強(qiáng)K1細(xì)胞遷移能力，加入干擾RNA抑制K1細(xì)胞遷移能力。
　　2.WNT/β-catenin信號(hào)通路在PFDA誘導(dǎo)

15、胃癌細(xì)胞增殖中的作用
　　2.1運(yùn)用DNA微陣列芯片比較PFDA實(shí)驗(yàn)組人胃癌AGS細(xì)胞與對(duì)照DMSO組人胃癌AGS細(xì)胞的差異。
　　研究方法:為研究PFDA調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖的新的分子機(jī)制，運(yùn)用DNA微陣列芯片比較PFDA處理后人胃癌AGS細(xì)胞與對(duì)照DMSO處理后人胃癌AGS細(xì)胞。利用QRT-PCR和Western blot驗(yàn)證PFDA處理組與DMSO對(duì)照組在mRNA與蛋白水平表達(dá)的差別，是否與DNA微陣列芯片結(jié)果一致。

16、>　　研究結(jié)果:在DAVID分析中，sPLA2-ⅡA(PLA2G2A)其表達(dá)是對(duì)照中的21.4％，并且在所有分析基因排第三個(gè)改變;sPLA2-ⅡA上游轉(zhuǎn)錄因子TCF4是第二個(gè)改變最多的基因，在PFDA實(shí)驗(yàn)組其表達(dá)降低至對(duì)照的19.9％。進(jìn)一步，利用QRT-PCR和Western blot證實(shí)DNA微陣列芯片分析結(jié)果。同時(shí)在Bel-7402細(xì)胞中得到進(jìn)一步的驗(yàn)證，PFDA處理組Bel-7402細(xì)胞與對(duì)照DMSO組Bel-7402相比，TC

17、F4與PLA2G2A的表達(dá)大幅度的降低。以上提示W(wǎng)NT/β-catenin信號(hào)通路在其中發(fā)揮重要作用。
　　2.2 PFDA對(duì)胃癌細(xì)胞(AGS)增殖能力的影響。
　　研究方法:通過CCK8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PFDA對(duì)AGS細(xì)胞的影響，分析不同濃度PFDA對(duì)AGS細(xì)胞的影響和不同全氟化合物對(duì)AGS細(xì)胞的效應(yīng)。
　　研究結(jié)果:CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與DMSO對(duì)照細(xì)胞相比，用一定濃度的PFDA孵育細(xì)胞可以顯著增加細(xì)胞數(shù)量。此

18、外，AGS細(xì)胞的增殖速度根據(jù)PFDA濃度不同而不同，這種劑量依賴性效應(yīng)由肝細(xì)胞系Bel-7402得到驗(yàn)證。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，與對(duì)照組細(xì)胞對(duì)比，PFDA可以增強(qiáng)細(xì)胞集落形成能力超過70％，顯著高于在相同濃度下其他全氟化合物（PFOS和PFOA）。
　　2.3 PFDA通過抑制衰老促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖。
　　研究方法:為了探索參與PFDA誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的細(xì)胞過程，利用流式細(xì)胞術(shù)，Western blot和SA-β-gal染

19、色來確定PFDA調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖是通過凋亡、自噬還是衰老。
　　研究結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)顯示PFDA處理組和DMSO對(duì)照組凋亡細(xì)胞百分比無顯著差異;Western blot結(jié)果回示與自噬相關(guān)的p62或LC3(LC3-Ⅱ)亦無顯著差異。綜合分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡和自噬都不是PFDA誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素。SA-β-gal染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在PFDA處理組中與細(xì)胞衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性明顯下降即SA-β-gal染

20、色的細(xì)胞數(shù)目減少和染色強(qiáng)度減弱。歸納上述試驗(yàn)結(jié)果證明細(xì)胞衰老在PFDA誘導(dǎo)AGS增殖的過程中發(fā)揮重要和關(guān)鍵作用。
　　2.4 TCF4和sPLA2-ⅡA對(duì)PFDA處理組胃癌細(xì)胞的增殖影響。
　　研究方法:探討WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活對(duì)細(xì)胞增殖的影響，利用CCK8，Western blot和QRT-PCR來確定WNT/β-catenin信號(hào)通路中的TCF4和sPLA2-ⅡA在PFDA處理組中是如何發(fā)揮促進(jìn)AGS

21、細(xì)胞增殖的作用。
　　研究結(jié)果:AGS細(xì)胞給以TCF4過表達(dá)質(zhì)粒和PLA2G2A過表達(dá)質(zhì)粒處理后，CCK8結(jié)果評(píng)價(jià)AGS增殖能力的變化。轉(zhuǎn)染TCF4過表達(dá)質(zhì)粒和PLA2G2A過表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率分別降低了60％和30％;然而，在TCF4過表達(dá)質(zhì)粒中加入干擾RNAPLA2G2A，細(xì)胞的增殖速率將會(huì)顯著提高，明顯高于僅轉(zhuǎn)染TCF4過表達(dá)質(zhì)粒的增殖速率。
　　Western blot和QRT-PCR結(jié)果回示:轉(zhuǎn)染TCF4過

22、表達(dá)質(zhì)粒和PLA2G2A過表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞恢復(fù)TCF4和sPLA2-ⅡA表達(dá)，PLA2G2A的表達(dá)與TCF4過表達(dá)質(zhì)粒和PLA2G2A過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量呈正相關(guān)性。然而，PLA2G2A過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量并不能影響TCF4表達(dá)。
　　概括上述結(jié)果:WNT/β-catenin信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子TCF4及其下游的sPLA2-ⅡA可以調(diào)節(jié)PFDA促AGS細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
　　2.5 sPLA2-ⅡA的表達(dá)可恢復(fù)細(xì)胞衰老并發(fā)揮抑

23、制AGS細(xì)胞增殖的作用.
　　研究方法:用SA-β-gal染色來檢測(cè)TCF4過表達(dá)質(zhì)粒、PLA2G2A過表達(dá)質(zhì)粒和干擾RNAPLA2G2A轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞衰老的影響。
　　研究結(jié)果:用TCF4過表達(dá)質(zhì)粒和PLA2G2A過表達(dá)質(zhì)粒分別處理AGS細(xì)胞后，PLA2G2A的表達(dá)都獲得恢復(fù)，衰老的細(xì)胞數(shù)量明顯增多和細(xì)胞染色強(qiáng)度增強(qiáng);加入干擾RNAPLA2G2A轉(zhuǎn)染后衰老細(xì)胞數(shù)量顯著減少和細(xì)胞染色強(qiáng)度也削弱。PFDA通過直接影響s

24、PLA2-ⅡA的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞衰老抑制，達(dá)到刺激細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
　　有趣的是，在實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)PFDA處理AGS可顯著刺激IL-1β和IL18分泌， IL-1β和IL-18誘導(dǎo)與NLRP3炎癥小體的激活有相關(guān)性。 PFDA不僅可以通過WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖，還可以刺激AGS細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體聚集。
　　結(jié)論:
　　第一部分:WNT/β-catenin信號(hào)通路在PTC發(fā)生中的作

25、用。
　　人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片分析PTC和相鄰正常組織發(fā)現(xiàn)，WNT10A/β-catenin信號(hào)通路在PTC發(fā)生過程中被激活。
　　參與WNT10A/β-catenin信號(hào)通路CCND1，RXRG，LEF1，MYC，CTNNB1，TPM3，WNT10A在PTC組織中表達(dá)呈上調(diào)狀態(tài)。
　　WNT10A/β-catenin信號(hào)通路的激活可促進(jìn)PTC細(xì)胞增殖。
　　WNT10A/β-catenin信號(hào)通路的激

26、活抑制PTC細(xì)胞晚期凋亡并發(fā)揮干擾細(xì)胞周期的效應(yīng)。
　　激活WNT10A/β-catenin信號(hào)通路可增強(qiáng)PTC細(xì)胞的遷移能力。
　　第二部分:WNT/β-catenin信號(hào)通路在PFDA誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖中的作用
　　WNT/β-catenin信號(hào)通路中的sPLA2-ⅡA和TCF4在PFDA處理組AGS細(xì)胞與DMSO對(duì)照組AGS細(xì)胞中表達(dá)有顯著差異。
　　PFDA促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞增殖。
　　PFDA通過抑

27、制細(xì)胞衰老施展促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞增殖的作用。
　　WNT/β-catenin信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子TCF4及其下游的sPLA2-ⅡA可以調(diào)節(jié)PFDA促AGS細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
　　sPLA2-ⅡA的表達(dá)可恢復(fù)胃癌細(xì)胞衰老并抑制胃癌細(xì)胞增殖。
　　意義:
　　1.WNT/β-catenin信號(hào)通路在PTC發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，WNT10A有可能為PTC臨床治療提供新靶點(diǎn)和新思路。
　　2.PFDA通過WNT/