AQP9過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究水通道蛋白9（Aquaporin9,AQP9）過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制研究。
　　方法：（第一部分）實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)正常肝細(xì)胞株L02和肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B及Huh-7中AQP9表達(dá)水平，并篩選出SMMC-7721作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)肝癌細(xì)胞株。將重組慢病毒LV-AQP9-GFP（以空載體LV-GFP作為陰性對(duì)照）導(dǎo)入SMMC-7721細(xì)胞中，構(gòu)建AQP9過

2、表達(dá)SMMC-7721/LV-AQP9重組細(xì)胞模型。激光共聚焦顯微鏡下觀察重組慢病毒LV-AQP9-GFP在SMMC-7721細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AQP9在SMMC-7721/LV-AQP9重組細(xì)胞模型中過表達(dá)水平。細(xì)胞腫脹實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AQP9過表達(dá)細(xì)胞模型中AQP9作為水通道功能活化程度。采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)AQP9過表達(dá)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移、侵襲的影響。
　　（第二部分）在動(dòng)物水平，將

3、 AQP9過表達(dá)重組肝癌SMMC-7721/LV-AQP9細(xì)胞和SMMC-7721/LV-GFP細(xì)胞接種于裸鼠皮下構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，動(dòng)態(tài)觀察2組裸鼠皮下移植瘤生長的差異。同時(shí)，通過尾靜脈注射重組肝癌SMMC-7721/LV-AQP9細(xì)胞和SMMC-7721/LV-GFP細(xì)胞構(gòu)建肝癌肺轉(zhuǎn)移模型，觀察2組裸鼠肺表面癌結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量，并采用HE染色觀察肺組織中轉(zhuǎn)移瘤的情況。
　　(第三部分）蛋白免疫印跡法檢測(cè)AQP9過表達(dá)重組肝癌S

4、MMC-7721/LV-AQP9細(xì)胞和SMMC-7721/LV-GFP細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白（E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin），PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、p-AKT及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9的表達(dá)差異。采用免疫組化法檢測(cè)移植瘤組織中 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：（第一部分）肝癌細(xì)胞株Hep3B不表達(dá)AQP9，而SMMC

5、-7721、HepG2、Huh-7中AQP9 mRNA和AQP9蛋白表達(dá)均較正常肝細(xì)胞株L02顯著降低（P值均＜0.05），其中SMMC-7721中AQP9 mRNA和AQP9蛋白表達(dá)量最低。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒LV-AQP9在SMMC-7721細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率為90％左右，并通過GFP熒光信號(hào)定位發(fā)現(xiàn)，AQP9-GFP融合蛋白綠色熒光主要分布在SMMC-7721/LV-AQP9細(xì)胞的細(xì)胞膜上。在SMMC-7721/L

6、V-AQP9重組細(xì)胞模型（AQP9組）中AQP9蛋白表達(dá)量較空載對(duì)照組SMMC-7721/LV-GFP細(xì)胞（GFP組）顯著增加（P＜0.01）。在低滲狀態(tài)下SMMC-7721/LV-AQP9重組細(xì)胞（AQP9組）膨脹體積較SMMC-7721/LV-GFP細(xì)胞（GFP組）顯著增大（P＜0.05），而用HgCl2（AQP9阻滯劑）阻滯水通道蛋白活性后，在低滲狀態(tài)下SMMC-7721/LV-AQP9重組細(xì)胞（AQP9組）和SMMC-7721/

7、LV-GFP細(xì)胞（GFP組）膨脹體積無顯著差異（P=0.783）。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，AQP9組細(xì)胞48h的遷移率（6.38%±1.70%）較GFP組（16.74%±1.40%）下降(P＜0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AQP9組48h穿過小室細(xì)胞數(shù)（57±8）較GFP組（95±11）減少（P＜0.01）。
　?。ǖ诙糠郑﹦?dòng)物水平，在裸鼠皮下移植瘤模型中，重復(fù)測(cè)量方差分析2組移植瘤體積提示，AQP9組移植瘤體積顯著小于GF

8、P組（F分組＝79.161，P分組＝0.000），AQP9組皮下移植瘤生長速度明顯小于GFP組（F分組×?xí)r間＝18.481，P分組×?xí)r間＝0.002）。在裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型中，HE染色觀察AQP9組裸鼠肺組織中轉(zhuǎn)移瘤體較GFP組更小，AQP9組裸鼠肺表面癌結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量較GFP組顯著減少（P＜0.05）。
　　（第三部分）Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示AQP9過表達(dá)后上皮表型標(biāo)志物（E-cadherin）、PI3K、P-AKT蛋白

9、表達(dá)上調(diào)（P值均＜0.05），間皮表型標(biāo)志物（N-cadherin）表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），而Vimentin、Akt、MMP9、MMP2蛋白表達(dá)水平較GFP組均無明顯變化（p值均＞0.05）。同樣，免疫組化及光密度分析結(jié)果顯示，AQP9組移植瘤中E-cadherin蛋白表達(dá)水平較GFP組上調(diào)（P＜0.05），AQP9組移植瘤中N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平較GFP組下調(diào)（P＜0.01）。
　　結(jié)論：肝癌細(xì)胞