蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在胃癌血清標(biāo)志物及三氧化二砷作用靶點發(fā)現(xiàn)研究中的應(yīng)用.pdf

1、隨著“人類基因組計劃”的完成和推進，生命科學(xué)研究已進入到系統(tǒng)生物學(xué)時代。蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門迅速崛起的系統(tǒng)生物學(xué)分支，通過研究機體在不同生理病理狀態(tài)下動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，來揭示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞的活動規(guī)律，在癌癥研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿?。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新興研究手段，以其高通量、并行、快速分析的優(yōu)勢在系統(tǒng)生物學(xué)研究中發(fā)揮著越來越重要的作用，必定能為癌癥的診斷和治

2、療研究提供很好的技術(shù)支持，使人們能夠較為系統(tǒng)地研究在癌癥診斷和治療過程中蛋白質(zhì)的組成、變化規(guī)律。在本論文的研究中，我們利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，圍繞胃癌診斷和治療相關(guān)的生物學(xué)問題，開展了尋找胃癌新型血清生物標(biāo)志物和藥物治療靶點的研究。
　　本論文首先將人蛋白質(zhì)組芯片技術(shù)運用到胃癌血清樣品的蛋白組學(xué)研究中，成功篩選出胃癌早期診斷和預(yù)后的血清生物標(biāo)志物。通過對三組血清樣本（胃癌組、高危人群組和健康對照組）的樣品處理、芯片反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析，在不

3、同血清樣本組間篩選出在三種抗體亞型（IgG、IgM、IgA）中存在顯著差異表達(dá)的自身抗體。通過更大規(guī)模的血清樣本在芯片上的驗證表明，我們篩選出44個在胃癌患者血清和健康人血清中顯著差異表達(dá)的自身抗體，其中4個在胃癌患者血清中的表達(dá)量顯著上調(diào)。我們對經(jīng)統(tǒng)計處理后排名最前的2個自身抗體，COPS2和CTSF，采用免疫酶聯(lián)反應(yīng)和免疫組化在血清水平和癌組織水平進行了詳盡的后期驗證工作。結(jié)果顯示，自身抗體 COPS2和CTSF在胃癌患者的血清中和

4、蛋白質(zhì)COPS2和CTSF在癌組織中的表達(dá)量跟正常對照組比較具有顯著差異。受試者工作特征曲線（ROC）分析結(jié)果顯示，COPS2和CTSF與目前臨床上使用的輔助胃癌診斷的生物標(biāo)志物CEA的ROC曲線下面積分別為0.92、0.96和0.54，說明COPS2和CTSF用于胃癌診斷的準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于CEA；此外，COPS2和CTSF同樣也能用于胃癌患者預(yù)后的判斷。上述結(jié)果均說明，COPS2和CTSF是非常有潛力的胃癌早期診斷和預(yù)后判斷的血清標(biāo)志物

5、。
　　接著，本論文將人蛋白質(zhì)組芯片技術(shù)引入到As2O3的藥物作用靶點探尋的研究中。As2O3治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的療效和機理十分明確，但是對實體腫瘤的殺傷作用機制不是很清楚。我們在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)As2O3能有效導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是藥物治療腫瘤最有效的方式?；诖?，我們利用人蛋白質(zhì)組芯片從系統(tǒng)水平進行 As2O3直接相互作用蛋白質(zhì)的全局性發(fā)現(xiàn)，篩選出與As2O3直接相互作用的一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)，期望從中能找到

6、 As2O3誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的具體作用機制。我們對篩選到的蛋白質(zhì)進行了體外、體內(nèi)及功能方面的驗證。并通過生物學(xué)功能分析，發(fā)現(xiàn)在這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，酶活性調(diào)節(jié)功能被顯著富集，主要集中在糖酵解途徑。我們進一步驗證了糖酵解途徑的重要限速酶己糖激酶 II在其中所發(fā)揮的作用。我們在選用人源胃癌細(xì)胞株SGC-7901基礎(chǔ)上，對細(xì)胞株進行己糖激酶II過表達(dá)的改造，結(jié)果表明過表達(dá)的己糖激酶II能顯著抑制As2O3對于胃癌細(xì)胞的殺傷作用，揭示了己糖激

7、酶II可以作為As2O3治療胃癌過程中重要的藥物作用靶點。
　　最后，我們應(yīng)用超高液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）平臺，對As2O3導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡的作用機制進行代謝組學(xué)方面的研究。我們通過對經(jīng)過As2O3處理6h、12h和24h的胃癌細(xì)胞株SGC-7901進行代謝產(chǎn)物的動態(tài)檢測分析，發(fā)現(xiàn)一部分代謝產(chǎn)物的變化集中在糖酵解途徑。其中6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸以及乳酸的含

8、量均明顯下降。除此之外，我們還檢測到As2O3可以影響線粒體的功能、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)以及抑制多胺的代謝等。代謝組學(xué)從系統(tǒng)層次對As2O3影響胃癌細(xì)胞的整體通路做了詳細(xì)的檢測和分析，得到的數(shù)據(jù)不僅僅與蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)相吻合，還找到了數(shù)個As2O3可能發(fā)揮作用的藥物作用靶點。由此可見，抑制糖酵解途徑可較有效地抑制胃癌細(xì)胞的增殖，同時As2O3可同時影響多個代謝通路的變化，可以從多方向多角度對胃癌的治療進行干預(yù)。
　　綜上所述，本課題