分泌蛋白質(zhì)組研究及其在肝細(xì)胞癌標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用.pdf

1、分泌蛋白參與機(jī)體免疫、凝血與抗凝血、物質(zhì)運(yùn)輸、營(yíng)養(yǎng)、細(xì)胞或組織之間通訊以及生長(zhǎng)信號(hào)調(diào)節(jié)等多種重要的生理過(guò)程，是新的治療方法和藥物靶點(diǎn)的豐富資源。血漿蛋白質(zhì)絕大部分由細(xì)胞或組織合成，經(jīng)過(guò)信號(hào)肽剪切、糖基化、磷酸化等翻譯后修飾加工之后分泌到血漿中，因此從某種意義上來(lái)講，血漿蛋白質(zhì)組涵蓋了分泌蛋白質(zhì)組的內(nèi)容。這里我們應(yīng)用多維色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了肝細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組，并且用可剪切型同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽技術(shù)(Cleavable Isotop

2、e-Coded Affinity Tags，cICAT)分析了AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞株HepG2和AFP陰性正常肝細(xì)胞株Chang liver分泌蛋白質(zhì)組之間的差異。我們總共鑒定了1778種人類蛋白質(zhì)，并成功地發(fā)現(xiàn)81種蛋白質(zhì)在它們之間存在著2倍以上的差異變化，其中31種蛋白質(zhì)在肝癌細(xì)胞HepG2分泌物中表達(dá)量增高。我們對(duì)這31個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行文獻(xiàn)查詢驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)12個(gè)蛋白質(zhì)在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中同樣在肝細(xì)胞癌(HCC)中表達(dá)量增高，例如AFP,載

3、脂蛋白E和玻連蛋白等；8個(gè)蛋白質(zhì)在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中在其它癌癥中表達(dá)量增高，例如補(bǔ)體C3和鋅α2糖蛋白等；僅1個(gè)蛋白質(zhì)在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中在其它癌癥中低表達(dá)。這些不僅說(shuō)明了從癌癥分泌蛋白質(zhì)組中尋找腫瘤標(biāo)志物策略的優(yōu)越性，同時(shí)也說(shuō)明了通過(guò)cICAT技術(shù)比較分析腫瘤分泌蛋白質(zhì)組來(lái)尋找癌癥標(biāo)志物的結(jié)果的可靠性和正確性。 隨后，我們用細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸的方法(Stable Isotope Labeling with Amino

4、 acids in Cell culture，SILAC)結(jié)合優(yōu)化的非標(biāo)記定量技術(shù)(Label-free Quantitative Technique，LFQ)分析了肝癌細(xì)胞株HepG2和正常肝細(xì)胞株L02分泌物之間的差異。以傳統(tǒng)的2倍差異為閾值，我們用LFQ分析3對(duì)不同實(shí)驗(yàn)中得到的同一組分(1:1)時(shí)，發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性率為2.9％±0.7％。LFQ在兩次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中定量得到的蛋白質(zhì)以及得到的蛋白質(zhì)的相對(duì)定量比值之間的重復(fù)性都相當(dāng)高。在兩次重

5、復(fù)的實(shí)驗(yàn)中有83％的蛋白質(zhì)被共同定量到，并且這些蛋白質(zhì)的相對(duì)定量比值之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性(PEARSON相關(guān)系數(shù)等于0.97)，兩次實(shí)驗(yàn)得到的蛋白質(zhì)相對(duì)定量比值之間的相對(duì)比率為1.02±0.45。與SILAC方法相比較，LFQ具有相同或者稍好的重復(fù)性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在相對(duì)定量雙方的豐度均較大時(shí)，LFQ能夠分析小于2倍的表達(dá)變化差異，具有更高的靈敏度。另外，SILAC方法和LFQ技術(shù)共同定量到的蛋白質(zhì)的相對(duì)定量比值，它們之間也具有很強(qiáng)的相關(guān)性(

6、PEARSON相關(guān)系數(shù)等于0.92)，說(shuō)明非標(biāo)記定量技術(shù)得到的蛋白質(zhì)相對(duì)定量比值同樣具有良好的可靠性?？偠灾菢?biāo)記定量方法并不亞于其它蛋白質(zhì)組定量方法如cICAT和SILAC，能夠精確和高通量地分析肝癌細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組，從中找到有價(jià)值的診斷和預(yù)后的血清學(xué)標(biāo)志物。我們結(jié)合SILAC和LFQ方法總共得到了299個(gè)蛋白質(zhì)在HepG2和LO2分泌蛋白質(zhì)組中存在著兩倍以上的表達(dá)差異。其中121個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的定量信息(≥2倍)至少在三次差異

7、定量分析中得到驗(yàn)證。結(jié)合前面從HepG2和Chang差異分泌蛋白質(zhì)組中得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，我們通過(guò)免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了載脂蛋白E、α1酸性糖蛋白1／2、AFP、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-7、TIMP-1和TIMP-2這幾個(gè)表達(dá)差異蛋白質(zhì)在肝癌患者血清和正常人血清之間的表達(dá)變化，有待成為有應(yīng)用價(jià)值的肝標(biāo)志物。 另外，我們用固相pH梯度等電聚焦蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了人類血漿的蛋白質(zhì)組成和特性。

8、隨后，我們以HepG2和LO2同位素標(biāo)簽的分泌物為中介分析了肝癌血漿和正常人血漿之間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，成功地得到300個(gè)血漿蛋白的定量信息。其中86種蛋白質(zhì)在肝癌患者血漿中表達(dá)量增高如AFP和載脂蛋白A-I等，60種蛋白質(zhì)在肝癌患者血漿中表達(dá)量降低如E1泛素激活酶和FK506結(jié)合蛋白4等。這些結(jié)果說(shuō)明用同位素標(biāo)簽分泌蛋白質(zhì)組做中介分析肝癌患者血漿跟正常人血漿之間的差異具有一定的可行性。 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和不斷完善，利