p38MAPK在Keap1-Nrf2-ARE通路對(duì)電針刺減輕兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)肺損傷中的作用.pdf

1、背景：內(nèi)毒素休克是由革蘭氏陰性菌大量死亡后釋放入血的內(nèi)毒素引起的小血管舒縮功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致患者微循環(huán)發(fā)生障礙，臨床表現(xiàn)為動(dòng)脈血壓降低、組織持續(xù)低灌注、微循環(huán)功能發(fā)生衰竭、代謝性酸中毒等，發(fā)生內(nèi)毒素休克時(shí)肺臟是極易受損的靶器官。當(dāng)機(jī)體發(fā)生內(nèi)毒素休克時(shí)，肺臟組織極易受損遷延乃至誘發(fā)肺損傷，若不及時(shí)防治可在短時(shí)間內(nèi)遷延發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合癥，甚至發(fā)生多器官功能衰竭綜合癥（MODS），是造成臨床危重癥患者死亡的主要原因之一。目前臨床上尚無(wú)特

2、異性的治療能有效地改善預(yù)后并降低其致死率。電針刺是以中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)針灸為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的，施針刺入相關(guān)穴位后，給予一定電流刺激，并且通過(guò)改變電流刺激的強(qiáng)度、頻率以及間隔時(shí)間等參數(shù)從而產(chǎn)生行針治療的效果。前期實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)使用電針刺激足三里穴（ST36）和肺俞穴（BL13）時(shí)，肺組織 Nrf2蛋白表達(dá)增加且核轉(zhuǎn)位增多，從而使肺臟組織血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase-1, HO-1）表達(dá)增加，使得內(nèi)毒素休克兔肺組織損傷程度減輕。p3

3、8MAPK是細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它屬于絲裂原活化蛋白激酶家族。p38MAPK激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，是傳導(dǎo)真核細(xì)胞信號(hào)的重要通路之一。對(duì)于電針刺對(duì)兔內(nèi)毒素休克致肺損傷中 Keap1-Nrf2/ARE通路的影響是否通過(guò)p38MAPK產(chǎn)生作用，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　目的：本研究通過(guò)觀(guān)察不同組別內(nèi)毒素休克致肺損傷兔模型中肺組織病理學(xué)評(píng)分、W/D、MDA含量及 SOD活性以及肺組織中 p38MAPK、磷酸化p38MAPK、Nr

4、f2表達(dá)水平、細(xì)胞核內(nèi) Nrf2蛋白的分布比率來(lái)明確 Keap1-Nrf2/ARE通路在電針刺激足三里和肺俞穴減輕兔內(nèi)毒素休克致肺損傷中的作用及其與p38MAPK通路之間的關(guān)系。
　　方法：80只健康的清潔級(jí)新西蘭大白兔，性別雄性，體重為1.5~2.0kg，2月齡，使用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)進(jìn)行分組，將其分成8組（n=10）：對(duì)照組（C組）、p38MAPK阻斷劑 SB203580組（S組）、內(nèi)毒素休克組(M組)、內(nèi)毒素休克+SB2035

5、80組（MS組）、電針刺穴位+內(nèi)毒素休克組（EAM組）、電針刺穴位+內(nèi)毒素休克+SB203580組（EAMS組）、電針刺非穴位+內(nèi)毒素休克組（SEAM組）、電針刺非穴位+內(nèi)毒素休克+SB203580組（SEAMS組）。EAM組和 EAMS組使用電針刺刺激足三里穴以及肺俞穴，使用疏密波，頻率為2-100Hz，強(qiáng)度以使兔產(chǎn)生輕微肌顫搐為宜，每天一次，持續(xù)30分鐘，連續(xù)進(jìn)行5天（1~4天施行電針刺預(yù)處理），在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從靜脈注射脂多糖（LPS）

6、開(kāi)始持續(xù)給予電針刺刺激，直至處死兔子。SEAM組與 SEAMS組使用同樣的頻率以及強(qiáng)度電針刺穴位旁開(kāi)0.5cm處進(jìn)行預(yù)處理。M組、MS組、EAM組、SEAM組、SEAMS組經(jīng)耳緣靜脈注射 LPS5mg/kg（溶于2ml生理鹽水），其余各組給予等量的生理鹽水。靜脈注射 LPS后2小時(shí)以?xún)?nèi)，平均動(dòng)脈壓下降至基礎(chǔ)值75％以下，即可認(rèn)為模型建立成功。內(nèi)毒素休克模型建立成功之后，S組、EAMS組、SEAMS組經(jīng)靜脈注射SB2035805μmol/

7、kg(溶于0.5ml無(wú)水乙醇)，其余組注射無(wú)水乙醇0.5ml。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始6小時(shí)后，經(jīng)頸動(dòng)脈采集動(dòng)脈血行血?dú)夥治?，后放血處死兔子，取肺臟組織進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察并予以評(píng)分，計(jì)算肺組織干濕重比，檢測(cè)肺組織 MDA含量以及 SOD活性，檢測(cè) p38MAPK以及 p-p38MAPK、Nrf2mRNA以及 Nrf2核蛋白和總蛋白的表達(dá)水平，檢測(cè) Nrf2的分布比率。
　　結(jié)果：（1）肺組織病理學(xué)評(píng)分：與 C組相比，S組肺組織損傷評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

8、＞0.05），其余各組肺組織損傷評(píng)分均增加(P＜0.05)；與 M組相比， MS組、SEAM組、SEAMS組肺組織損傷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， EAM組、EAMS組肺組織損傷評(píng)分降低(P＜0.05)；與 EAM組相比較，EAMS組肺組織損傷評(píng)分增加(P＜0.05)。(2)肺組織W/D：與C組相比，S組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組肺組織 W/D值均增加(P＜0.05)；與 M組相比， MS組、SEAMS組 W/

9、D值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，EAM組、EAMS組肺組織 W/D降低(P＜0.05)；與 EAM組相比，EAMS組肺組織 W/D增加(P＜0.05)。（3）肺組織MDA含量以及SOD活性：與C組相比，S組MDA含量以及 SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組 MDA含量增加且 SOD活性降低(P＜0.05)；與 M組相比，MS組、EAMS組、SEAM組、SEAMS組MDA含量以及SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

10、05)，EAM組MDA含量降低， SOD活性顯著增加(P＜0.05)；與 EAM組比較，EAMS組 MDA含量增加， SOD活性降低(P＜0.05)。（4）p38以及 p-p38蛋白的表達(dá)：與 C組相比，S組p38以及p-p38差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組p38以及p-p38表達(dá)均上調(diào)(P＜0.05)；與M組相比較，EAM組、EAMS組p38以及p-p38表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；與 EAM組相比，EAMS組 p38以及

11、p-p38表達(dá)降低(P＜0.05)。（5） Nrf2 mRNA：與C組比較，S組表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組Nrf2 mRNA的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)；與M組比較，EAM組Nrf2 mRNA的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)，而SEAM組、EAMS組以及SEAMS組的Nrf2 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（6）Nrf2核蛋白：與 C組比較，S組 Nrf2核蛋白無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組表

12、達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；與 M組相比較， MS組、EAM組、EAMS組 Nrf2核蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而 SEAM組、SEAMS組Nrf2核蛋白無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EAM組相比較，EAMS組Nrf2核蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。（7）Nrf2總蛋白：與 C組相比，EAM組、EAMS組以及 SEAM組 Nrf2總蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與 M組相比較，EAM、EAMS

13、組 Nrf2總蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)；與 EAM組相比，EAMS組 Nrf2總蛋白降低(P＜0.05)。（8）細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的分布比率：與C組相比，S組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的分布比率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組 Nrf2分布比率增加（P＜0.05)；與 M組相比較， EAM組、EAMS組 Nrf2蛋白分布比率增加(P＜0.05)，SEAM組、SEAMS組Nrf2蛋白分布比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。