RNAi沉默AEG-1基因?qū)θ四I癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的：
　　本研究通過構(gòu)建AEG-1的shRNA干擾質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腎癌細胞株，探討下調(diào)AEG-1的表達對腎癌細胞增殖、細胞周期、癌細胞凋亡和對5-氟尿嘧啶敏感性的影響及相關生物學機制。這些結(jié)果表明沉默AEG-1基因可以抑制細胞的增殖和集落形成，延緩及阻滯細胞周期于G0/G1期，最終促進腎癌細胞凋亡，并增加了化學藥物敏感性。因此，AEG-1在腎細胞癌的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用并可能成為對腎細胞癌進行基因治療的潛在靶點。<

2、br>　　材料和方法：
　　一、細胞培養(yǎng)
　　人類腎癌細胞株Caki-1從中科院上海細胞所獲取，培養(yǎng)瓶中加入McCOY's5A培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich，USA)和10％胎牛血清，在條件為37℃和5％ C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天細胞密度為80％左右，更換培養(yǎng)液并加入0.25％的胰蛋白酶進行細胞消化傳代。
　　二、質(zhì)粒構(gòu)建
　　用pGCsi-H1作為載體(GeneChem，China)構(gòu)建pGC

3、si-H1-AEG-1的干擾質(zhì)粒。
　　三、細胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選
　　腎癌Caki-1細胞鋪于6孔板中，調(diào)整細胞密度為1.0×105/孔，過夜培養(yǎng)。
　　四、Real-time PCR
　　總RNA提取試劑盒(Invitrogen)提取各組細胞總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明(Takara,中國)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應結(jié)束后采用BIONEER公司ExicyclerTM96熒光定量儀進行定量分析。

4、>　　五、Western Blot
　　加入蛋白裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology，China)及PMSF提取總蛋白，冰上放置40 min，4℃12000 rpm/min離心40 min，取上清，BCA法定量蛋白。用Image J software檢測條帶的灰度值，進而確定各組蛋白的表達量。β-actin作為內(nèi)參。
　　六、免疫組化和免疫熒光
　　免疫組化:臨床病理標本取下后

5、多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，免疫組化SP法進行染色，倒置顯微鏡觀察。免疫熒光:腎癌Caki-1細胞鋪在載玻片上，進行細胞制片用4％多聚甲醛固定，4℃孵育過夜。
　　七、細胞增殖實驗
　　細胞增殖通過3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法進行檢測。
　　八、克隆形成實驗
　　細胞以300個/皿的密度接種培養(yǎng)，每隔3天換液，37℃下培養(yǎng)細胞10-14天可形成肉眼可見的克隆，PBS洗

6、滌細胞兩次后用甲醇固定細胞。去除甲醇，PBS清洗3次，用瑞姬氏復合染料染色10 min，清水沖洗3次后拍照。顯微鏡下計數(shù)，大于等于50個細胞的細胞團為克隆數(shù)。
　　九、流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡
　　對于檢測細胞周期，細胞用胰酶消化后用70％預冷的乙醇固定過夜。在細胞中加入碘化丙啶(PI)和RNase(50μg/ml)，37℃孵育30min。通過流式細胞儀(BDBiosciences，美國)檢測不同時期的細胞百分數(shù)。細胞凋

7、亡用AnnexinV FITC/PI凋亡試劑盒(KeyGen Biotech，中國)進行檢測。細胞密度達到80％后，用胰蛋白酶消化細胞，PBS清洗細胞。用500μl Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細胞。加入5μl FITC-標記AnnexinV溶液和5μl PI溶液，室溫下避光孵育15 min。冰浴避光存放，流式細胞儀進行檢測。
　　十、Hoechst33258染色
　　Hoechst33258染色用來檢測細胞核的變化和凋

8、亡小體的形成。細胞達到80％融合以后，用4％多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌細胞。用Hoechst33258染色液(Beyotime Institute of Biotechnology)室溫下孵育30 min。棄去染色液滴加抗熒光淬滅封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察，400倍鏡下進行圖像采集數(shù)據(jù)分析。
　　十一、統(tǒng)計學分析
　　所有的實驗重復三次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間的差異用單因素方差分析(one way ANO

9、VA)進行分析，多因素分析使用Bonferroni因果分析，GraphpadPrism5.0用于計算數(shù)據(jù)和制作圖形表格。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　一、AEG-1在腎癌組織中表達升高。
　　免疫組化實驗中AEG-1在腎癌組織蠟塊切片中明顯高表達，相反的，正常的癌旁腎臟上皮細胞免疫組化實驗或是沒有蛋白表達或是表達微弱。實驗可見，AEG-1主要在細胞質(zhì)和核周顯色，AEG-1蛋白的表達與腫瘤T分期、腫

10、瘤病理分級和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(P＜0.05)。
　　二、形成沉默AEG-1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)Caki-1細胞株。
　　為了研究AEG-1在腎癌中的作用，我們構(gòu)建了質(zhì)粒攜帶AEG-1 shRNA和陰性對照shRNA。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎癌Caki-1細胞后，篩選并獲得經(jīng)過G418耐受的細胞系，并且通過Real-time PCR and Western blot分析檢測AEG-1的表達情況。結(jié)果顯示AEG-1 shRNA介導的AEG-1的mRNA

11、和蛋白表達分別減少了72％和74％(P＜0.01)。免疫熒光分析結(jié)果表明AEG-1最初表達于細胞質(zhì)和核周區(qū)域，與對照組相比，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的細胞AEG-1熒光密度明顯降低。上述結(jié)果表明質(zhì)粒攜帶AEG-1的干擾片段植入腎癌Caki-1細胞后在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都有效的沉默了AEG-1的表達，可以作為后續(xù)研究的有力的工具。
　　三、沉默AEG-1基因抑制Caki-1細胞的增殖和克隆。
　　我們用MTT實驗檢測沉默AEG-

12、1基因?qū)δI癌Caki-1細胞增殖能力的影響。AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染細胞72小時后，增殖能力明顯減低，明顯低于與對照組(P＜0.01)，在接下來的96小時和120小時均明顯低于對照組(P＜0.01)。結(jié)果表明，沉默AEG-1基因抑制Caki-1細胞的增殖和克隆。
　　四、沉默AEG-1將Caki-1細胞周期阻滯于G0/G1期。
　　為了進一步的理解AEG-1調(diào)節(jié)細胞增殖的深層機制，我們檢測沉默AEG-1對細胞周期的影響。與

13、對照組相比，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的細胞阻滯于G0/G1期的細胞數(shù)量明顯增加(P＜0.01)。同時，處于S期的細胞比例明顯減少(P＜0.01)。此外，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染后sub-G1期的凋亡細胞的比例增加明顯(P＜0.01)。Westernblot結(jié)果表明與對照組相比，轉(zhuǎn)染后的細胞周期蛋白D1和E的表達顯著減少(P＜0.01)。因此，沉默AEG-1基因可以將細胞生長阻滯于G0/G1期，因此抑制了細胞增殖。
　　五、沉默

14、AEG-1可以促進Caki-1細胞凋亡。
　　我們采用Hoechst染色和流式細胞術(shù)檢測沉默AEG-1基因?qū)毎蛲龅挠绊?。從Hoechst染色的典型結(jié)果中可以看出，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染過的細胞具有明顯的凋亡小體，在對照組中卻很少發(fā)現(xiàn)有凋亡小體存在。通過Annexin V-FITC/PI染色檢測細胞凋亡的比例，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的凋亡細胞的比例(19.91±4.85％)明顯高于control shRNA轉(zhuǎn)染的陰性對照

15、組（5.29±1.47％）和沒有轉(zhuǎn)染的空白對照組（4.58±1.36％）(P＜0.01)。此外，Westemblot結(jié)果表明在Caki-1細胞中，AEG-1shRNA轉(zhuǎn)染后明顯減低Bcl-2蛋白的表達且增加了Bax、cleaved-PARP和caspase-3蛋白的表達(P＜0.01)。因此，我們的結(jié)果顯示AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染后抑制細胞的增長也能導致細胞的體外凋亡。
　　六、沉默AEG-1增加腎癌細胞對5-FU的化學敏感性。

16、
　　為了進一步研究沉默AEG-1基因?qū)aki-1細胞化療藥物（5-氟尿嘧啶，5-FU）敏感性的影響，我們用依次遞增的5-FU濃度處理陰性對照組、空白對照組和AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染組細胞，細胞維持48小時，然后用MTT法檢測細胞活力。我們發(fā)現(xiàn)5-FU處理可以引起濃度依賴性的生長抑制，與對照組相比，5-FU對AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染的細胞的抑制率明顯增加(P＜0.01)。更重要的是，與單獨5-FU處理陰性對照組和空白對照組細

17、胞相比(IC50:43μg/ml in Caki-1 cells and40μg/mlin control AEG-1 cells)，AEG-1 shRNA結(jié)合5-FU處理Caki-1細胞可以促使IC50值明顯下降(22μg/ml)。然后，用22μg/ml的5-FU處理并且收集細胞用作細胞增殖和凋亡分析。與對照相比，AEG-1 shRNA轉(zhuǎn)染組細胞對5-FU敏感性增高，這與MTT試驗和流式細胞術(shù)的結(jié)果是一致的。
　　結(jié)論: