RNA干擾靶向沉默PAUF基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測(cè)胰腺腺癌上調(diào)因子（pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor，PAUF）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況，并通過(guò)RNA干擾靶向沉默PAUF表達(dá)，觀察其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖凋亡及侵襲能力的影響，探討PAUF基因在結(jié)腸癌中的作用，為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.收集48例結(jié)腸癌標(biāo)本，每份標(biāo)本同時(shí)收取腫瘤組織

2、和癌旁正常組織。分別采用RT-PCR，免疫組化檢測(cè)各組織中PAUF和β-catenin的表達(dá)水平。培養(yǎng)5株結(jié)直腸癌細(xì)胞株，RT-PCR檢測(cè)各細(xì)胞株中PAUF表達(dá)水平，進(jìn)而篩選出高表達(dá)細(xì)胞株HCT116以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。
　　2.以脂質(zhì)體（lipofectamine TM2000）為載體將帶熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)從而篩選出最佳轉(zhuǎn)染條件。設(shè)計(jì)制備針對(duì)PAUF基因的3組不同小干擾RNA序列，以最佳轉(zhuǎn)染條

3、件轉(zhuǎn)染細(xì)胞后分別采用RT-PCR以及Western法驗(yàn)證干擾效果并進(jìn)而篩選出最佳干擾片段以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。
　　3.將先前篩選出的最佳干擾片段PAUF-siRNA2按最佳轉(zhuǎn)染條件對(duì)PAUF高表達(dá)細(xì)胞株HCT116進(jìn)行RNA干擾，再分別采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法，流式細(xì)胞術(shù)（FCM），侵襲實(shí)驗(yàn)，粘附實(shí)驗(yàn)，遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA沉默PAUF后對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖，凋亡、周期及侵襲、粘附、遷移性的影響。
　　結(jié)果：
　

4、　1.癌旁組織中PAUF和β-catenin的表達(dá)量明顯低于腫瘤組織(P<0.05)。并且，在腫瘤組織和癌旁組織中PAUF的表達(dá)與β-catenin的表達(dá)均呈現(xiàn)相關(guān)性(P<0.05)。 PAUF在5株結(jié)直腸癌細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，但在HCT116中表達(dá)量最高。
　　2.細(xì)胞數(shù)約為每孔1.5×105個(gè)、siRNA濃度約為80pmol，Lipofectamine2000與siRNA比例為4ul:4ul(6孔板)時(shí)，有較佳的轉(zhuǎn)染效率

5、，繼續(xù)提高siRNA濃度并不能明顯提高轉(zhuǎn)染效率。將三組siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后PAUF表達(dá)量均有不同程度下降，其中以PAUF-siRNA2干擾效果最明顯，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后PAUF和β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降。
　　3.轉(zhuǎn)染了PAUF-siRNA2的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116吸光度值降低，增殖活力下降，生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞凋亡增加，且大部分停留在G2/M期，同時(shí)，細(xì)胞的侵襲、粘附及遷移性減低。
　　結(jié)論：PAUF基因在結(jié)腸癌中