一株多糖高產(chǎn)菌株的研究與應(yīng)用.pdf

1、隨著糖化學(xué)、糖生物學(xué)、糖工程學(xué)發(fā)展，人們已認(rèn)識到多糖物質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用前景；20世紀(jì)90年代以來，多種新方法、新技術(shù)被應(yīng)用于多糖物質(zhì)的研究中，一些不同生理活性的多糖物質(zhì)被分離、純化和鑒定，部分研究成果所形成的產(chǎn)品已投放市場，并顯示出良好的經(jīng)濟效益。但大多數(shù)多糖產(chǎn)品主要來自高等植物和海藻及較大型的真菌，這在一定程度上限制了多糖的生產(chǎn)、應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化進程。 近年來，由于細(xì)菌多糖具有結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定、價格

2、便宜、生產(chǎn)周期短及生產(chǎn)可控等優(yōu)點而倍受關(guān)注。本文對一株高產(chǎn)胞外多糖的細(xì)菌菌株進行了研究，主要內(nèi)容為：菌株分離、篩選，發(fā)酵工藝優(yōu)化、多糖提取工藝優(yōu)化、多糖制品化學(xué)組成分析及其應(yīng)用。 出發(fā)菌株為課題組自行分離所得的一株多糖產(chǎn)量較高的菌株，經(jīng)生理生化特性分析及16SrDNA序列鑒定，鑒定該菌株為土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)的放射形土壤桿菌(A.radiobacter)，菌株編號為GY04。 本課題組歷經(jīng)二年左

3、右時間，做了大量的工作，并取得了如下階段性進展：1.采用無氮培養(yǎng)基、復(fù)篩培養(yǎng)基及基本發(fā)酵培養(yǎng)基從貴陽市郊土壤中篩選得到一株野生菌株，編號為GY04。經(jīng)形念學(xué)觀察、生理生化特性分析及16SrDNA序列分析，確定該菌株為土壤桿菌屬的放射形土壤桿菌(A.radiobacter)。GY04為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞呈桿狀，大小為1.2μm～1.8μm×0.5μm～0.8μm，單個或成對；莢膜染色顯示，該菌株可產(chǎn)生莢膜；在基本發(fā)酵培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3

4、～4d，菌落呈乳白色、有光澤、不透明、中凸、圓整、粘稠，菌落直徑1cm左右。 GY04菌株好氧，生長溫度范圍為4℃～42℃，最適溫度28℃，生長pH范圍4～9，最適pH為7.0左右，不產(chǎn)色素，無芽孢，無動力，不能利用檸檬酸鹽，可以產(chǎn)生3-酮基乳糖，并且可以利用乙醇氧化產(chǎn)酸，在石蕊牛奶培養(yǎng)基中產(chǎn)酸。 GY04菌株生長的延滯期為0～6h，6h后進入對數(shù)生長期，至96h生長量達到最大，96h至120h是GY04菌株生長的穩(wěn)定期

5、，120h后進入衰亡期。 2.GY04菌株的生長與產(chǎn)膠為非偶聯(lián)型，對數(shù)生長期結(jié)束后開始分泌大量的胞外多糖。在搖瓶發(fā)酵條件下，GY04菌株產(chǎn)生多糖的最佳氮源為午肉膏，最佳碳源為乙二醇，發(fā)酵周期為5d。 將常規(guī)的優(yōu)化法與統(tǒng)計學(xué)方法相結(jié)合，以胞外多糖的產(chǎn)量為指標(biāo)，應(yīng)用均勻設(shè)計法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS10.0對結(jié)果進行分析，得到回歸方程Y=0.223+1.835X1-0.106X2-0.0831X4-0.06

6、42X5+0.02853X6，并根據(jù)方程得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝：牛肉膏0.20g/100mL，乙二醇0.25mL/100mL，碳酸鈣0.20g/100mL，初始pH值7.0，接種量7％。與原有發(fā)酵條件相比，在最優(yōu)條件下多糖產(chǎn)量提高了75.13％。 3.采用離心除菌、真空濃縮、95％乙醇沉淀、無水乙醇和乙醚洗滌、Sevage試劑脫蛋白等步驟處理發(fā)酵液可得到精制多糖。其工藝流程為： 離心—→80℃真空濃縮至原體積1/4—→3倍濃

7、縮液體積的95％乙酵溶液沉淀—→過濾沉淀—→無水乙醇、乙醚洗滌沉淀—→粗多糖—→Sevage法除蛋白—→精制多糖 確定了多糖提取及初步純化的方法，在降低提取純化過程的成本的目標(biāo)下，得到了較純的精制多糖制品。 4.精制多糖樣品為白色粉末。該樣品不溶于水、NaOH溶液及醇、酮、醚等有機溶劑，微溶于二甲基亞砜溶液，溶于1M的鹽酸溶液，該多糖樣品的酸溶液為微黃色澄清溶液，可能是由于部分多糖被酸化造成水解而使溶液變得微黃。多糖樣品

8、在水溶液中形成懸濁液，1％的多糖懸濁液在加熱時可形成微凝膠。 GY04菌株所產(chǎn)胞外多糖是一種新型的以葡萄糖、鼠李糖兩種單糖組成的雜多糖，其紅外譜顯示此多糖是一種吡喃多糖，含有乙?；＿\用電子探針二次電子成像分析技術(shù)得到了該多糖樣品的幾種“晶形”，并且通過元素分析證明該菌株可以分解鉀長石，并釋放出部分營養(yǎng)元素。 5.在對多糖結(jié)構(gòu)與性質(zhì)初步了解的基礎(chǔ)上，對其應(yīng)用作了如下探討，具體表現(xiàn)在對生活污水的處理及在土壤水土保持方面：由

9、GY04菌株所制成的含有大量多糖產(chǎn)物的菌劑在對生活污水的處理中，取得了較好效果；在增強土壤持水能力方面也有顯著效果。究其原因，作者認(rèn)為，與其胞外多糖的性質(zhì)是分不開的，一方面胞外多糖本身為大分子物質(zhì)，它可以有效吸附懸浮物；另一方面，多糖分子中含有極性基團和未飽和殘基，這使微生物絮凝劑分子借助離子鍵、氫鍵、范德華力的作用吸附多種帶電顆粒，而降低粒子間的斥力勢能使溶膠聚沉并可以吸附水分而使得土壤持水能力提高。 通過本論文對GY04菌株