高產(chǎn)多糖白靈菇菌株的誘變選育及其多糖的研究.pdf

1、白靈菇(Pleurotusnebrodensis)，隸屬擔子菌亞門(Basidiomycolina)，層菌綱(Hymenomyceles)，傘菌目(Agariates)，側耳科(Pleurotaceae)，側耳屬(Pleurotus)。它是一種食藥價值很高的大型真菌，其生物活性物質(zhì)有效組分—食藥用真菌多糖的含量很高。白靈菇在液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中也可產(chǎn)生真菌多糖即胞內(nèi)多糖和胞外多糖，但產(chǎn)量較低。 本課題研究了白靈菇多糖高產(chǎn)菌的誘

2、變選育、發(fā)酵條件及其活性多糖的提取、分離純化、結構和活性功能。主要研究內(nèi)容和結論如下：1.性能良好的出發(fā)菌株是獲得高產(chǎn)量微生物代謝產(chǎn)物的基礎，因此本論文對收集到的5株白靈菇菌株即JZ、JT、FZ、FB和PJ進行初篩。主要以PDA固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基(不加瓊脂的PDA)為營養(yǎng)源，以生物量和胞外多糖產(chǎn)量為篩選目標對該5株菌株進行自然篩選比較。在固體培養(yǎng)基上FZ、FB和PJ3株菌株，暗白色，菌絲稀疏，不整齊，生長慢，易污染；而JZ、JT線性

3、生長速度快、菌落潔白色，菌絲粗壯，長勢旺盛；將在固體培養(yǎng)基上生長快的JZ、JT進行液體培養(yǎng)，其中JZ生長略快于JT，而且生物量多糖均略高于JT。確定以JZ作為出發(fā)菌株。 2.采用酶解白靈菇菌絲體得到的原生質(zhì)體作為誘變材料，通過紫外線，He-Ne激光單一和復合方法對白靈菇JZ的原生質(zhì)體進行反復誘變，篩選出生命力旺盛且適合于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的和適于栽培的白靈菇突變株JZ-FH16。在未優(yōu)化條件下進行液體培養(yǎng)，JZ-FH16比出發(fā)菌株的生

4、物量提高10.93％，胞外多糖產(chǎn)量提高16.22％。經(jīng)驗證，菌株JZ-FH16的遺傳性能穩(wěn)定。 3.通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗和響應面分析試驗對胞內(nèi)多糖和胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，分別得到胞內(nèi)多糖(A)和胞外多糖(B)最佳培養(yǎng)基配方：A：豆粕粉2.41g/L、MgSO4·7H2O0.48g/L、麩皮5.58g/L、玉米淀粉+葡萄糖41.08g/L、KH2PO42g/L、VB110mg/L；

5、B：豆粕粉1.87g/L、MgSO4·7H2O0.70g/L、麩皮2.05g/L、玉米淀粉+葡萄糖48.3g/L、KH2PO42g/L、VB110mg/L。 通過單因素試驗對胞內(nèi)多糖和胞外多糖的發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，分別確定了較優(yōu)的胞內(nèi)多糖(C)發(fā)酵工藝參數(shù)和胞外多糖的發(fā)酵工藝參數(shù)(D)：C：發(fā)酵溫度26℃、初始pH值6、接種量15％、裝料量20％、搖床轉(zhuǎn)速160r/min、發(fā)酵周期8d； D：發(fā)酵溫度26℃、初始pH

6、值6、接種量10％、裝料量20％、搖床轉(zhuǎn)速160r/min、發(fā)酵周期8d。 在上述優(yōu)化條件下進行發(fā)酵試驗，分別得到白靈菇菌株JZ-FH16的生物量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量和胞外多糖產(chǎn)量為29.4g/L、1.34g/L、2.98g/L，比初始條件下的20.19g/L、0.98g/L、2.15g/L、分別提高了45.62％、36.73％、38.6％。 4.對菌株JZ-FH16的子實體和菌絲體的營養(yǎng)成分進行全面分析。研究結果為：白靈菇子

7、實體、菌絲體中的氨基酸總量和必需氨基酸占總氮比例遠高于FAO標準模式，均含有8種必需氨基酸；白靈菇菌絲體的必需氨基指數(shù)、生物價、營養(yǎng)指數(shù)比子實體高。子實體和菌絲體的總脂肪酸中不飽和脂肪酸含量分別高達82.5％和75.1％。子實體與菌絲體中鐵、鋅、鉀、鈉等礦物質(zhì)含量大體相同，其中富含人體易缺乏的必需微量元素鐵、鎂、鋅等，菌絲體中的鈣、鎂、錳含量遠高于子實體。 5.采用通用旋轉(zhuǎn)組合設計試驗法分別對熱水法提取白靈菇子實體多糖PNFP和

8、菌絲體多糖PNMP的工藝參數(shù)進行研究，得到PNFP(A)和PNMP(B)的最佳提取工藝條件為：A：提取時間5.4h，液固比67.8倍，提取溫度98.4℃；B：提取時間3.8h、液固比52.5倍、提取溫度95℃。 在此條件下進行驗證試驗，得到PNFP和PNMP的得率分別為9.93％和6.39％。采用正交回歸旋轉(zhuǎn)組合設計試驗法分別對酶解法提取PNFP和PNMP的工藝參數(shù)進行研究，得到PNFP(C)和PNMP(D)的最佳提取工藝條件為

9、：C：酶用量3.06％，酶解溫度44.9℃，酶解時間3.8h，pH值6.7；D：酶用量2.53％、酶解溫度39.6℃、酶解時間3.2h、pH值7.2。在此條件下進行驗證試驗，得到PNFP和PNMP的得率分別為12.37％和8.23％。 酶解法比熱水法提取白靈菇子實體中的多糖得率提高了24.57％，酶解法比熱水法提取白靈菇菌絲體中的多糖得率提高了28.79％。 采用L9(34)正交試驗進行白靈菇胞外多糖(PNEP)工藝參數(shù)

10、研究，得到PNEP的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度100％、乙醇倍數(shù)4、醇沉時間12h，胞外多糖含量可達3.08g/L。 6.白靈菇子實體粗多糖PNFP、菌絲體粗多糖PNMP、胞外粗多糖PNEP經(jīng)過Sevag法脫蛋白、H2O2脫色、透析、DEAE-纖維素離子交換層析、SephadexG-200凝膠過濾后，獲得純多糖PNFPⅡ-a、PNMPⅢ-a和PNEPⅠ-a，三者均為白色粉末。經(jīng)HPLC法測定，三者的分子量依次為7250Dal、

11、15213Dal、10863Dal，均為水溶性多糖。 通過酸水解、紅外光譜分析，確定PNFPⅡ-a是由葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖四種單糖組成，且含有α型糖苷鍵的多糖。PNMPⅢ-a由葡萄糖、鼠李糖、木糖和核糖四種單糖組成，并含硫酸酯鍵、β-糖苷鍵的蛋白多糖。PNEPⅠ-a由葡萄糖、核糖、甘露糖三種單糖組成，且含有α型糖苷鍵的多糖。 7.PNFPⅡ-a可以提高機體的免疫功能；PNMPⅢ-a可以全面地提高機體的免疫功能；PN

12、EPⅠ-a具有很強地提高機體免疫功能的作用，但三者所起的免疫調(diào)節(jié)作用途徑是不完全相同的。PNFPⅡ-a、PNMPⅢ-a和PNEPⅠ-a的最適作用劑量分別為30mg/kg、20mg/kg、30mg/kg。 8.純多糖PNFPⅡ-a、PNMPⅢ-a和PNEPⅠ-a對·OH均有清除作用，PNMPⅢ-a的清除·OH效果最好，清除率最高為72.19％。 純多糖PNFPⅡ-a、PNMPⅢ-a和PNEPⅠ-a都具有一定清除O2-的能力