麻瘋樹（Jatropha curcas）毒蛋白curcin2基因的原核表達(dá).pdf

1、核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是一類作用于rRNA而抑制核糖體功能的毒蛋白，廣泛存在于高等植物中。研究表明，RIP對(duì)于細(xì)菌真菌具有廣普抗性。另一方面，核糖體失活蛋白能抑制腫瘤病毒和艾滋病毒的生長(zhǎng)。 麻瘋樹(Jatropha curcas)為大戟科麻瘋樹屬的一種油料植物，抗病蟲和耐干旱能力強(qiáng)，在熱帶和亞熱帶地區(qū)有大量分布，是一種具有較大開發(fā)潛能的植物。從麻瘋樹的種子中分離純化

2、到一種毒蛋白(curcin)，經(jīng)鑒定是一種核糖體失活蛋白，已克隆了其基因，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。Curcin2是在低溫(或高溫)、干旱、真菌等逆境脅迫時(shí)，麻瘋樹產(chǎn)生的一種核糖體失活蛋白。為了進(jìn)一步研究curcin2基因的結(jié)構(gòu)和功能，為開發(fā)利用curcin2奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了curcin2基因的兩種原核表達(dá)載體pET-C和pQE-C。并分別在E.coli B121和M15誘導(dǎo)表達(dá)，以比較curcin2基因的這兩種原核表達(dá)系統(tǒng)的差異。

3、在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了curcin2原核表達(dá)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的存在形式。 (1)兩個(gè)原核表達(dá)載體的構(gòu)建：用根據(jù)curcin2基因序列(GenBank登錄號(hào)：AY435214)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增成熟肽編碼區(qū)的特異性引物:P1:5’-GGATCC(BamHI)ATGGCTGGTTCCACTTT-3’; P2 :5’-GAGGCTC ( Sac I )ATACATTGGAAAGATGAG GA-3’, 以提取的麻瘋樹基因組DNA為模板進(jìn)行

4、PCR擴(kuò)增，回收PER產(chǎn)物并連接到pMD18-T載體，獲重組子pMD-18T/curcin2，轉(zhuǎn)化E.coli JMl09。經(jīng)測(cè)序以驗(yàn)證目的片段序列的正確性。用BamHI和SacI對(duì)重組質(zhì)粒pMD-18T/curcin和表達(dá)載體pET-32(c)、pQE-30進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，得到帶互補(bǔ)粘性末端的curcin2基因片段(約930 bp)和pETF-32(c)、pQE-30的線性表達(dá)載體。用T4 DNA連接酶將所得的目的片斷分別與

5、線形表達(dá)質(zhì)粒pET-32(c)、pQE-30在16V下連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體pETF-C和pQE-C。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E.coli JMl09，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，證明目的片段curcin2正確插入表達(dá)載體，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-C和pQE-C。 (2)兩種重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)：將含有重組子pET-C、pQE-C的E.coli JMl09轉(zhuǎn)化菌于37℃下擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。把重組質(zhì)粒pET-C轉(zhuǎn)入感受

6、態(tài)的E.coliBL21，重組質(zhì)粒pQE-C轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E coli M15。經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，證明成功獲得轉(zhuǎn)化子PCB和PCM。用不同的誘導(dǎo)溫度，不同的誘導(dǎo)時(shí)間及不同的IPTG誘導(dǎo)濃度同時(shí)作用兩種重組菌PCB和PCM。經(jīng)SDS-PAGE和Westem-blotting檢測(cè)，結(jié)果表明，在任何誘導(dǎo)條件下，重組子PCB都沒有curcin2重組蛋白產(chǎn)生，而PCM都能表達(dá)出curcin2的重組蛋白，但主要以包函體形式存在。在本實(shí)驗(yàn)