肺炎支原體MLVA分型及其臨床意義.pdf

1、目的:
　　近年來隨著肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）基因組學(xué)研究的發(fā)展，關(guān)于MP基因型與MP菌株變異、病情進(jìn)展、耐藥及治療等方面的關(guān)系受到了越來越多的關(guān)注。在分子水平上對MP菌株進(jìn)行分型可以較好地進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測并研究疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。目前國內(nèi)外對MP菌株的傳統(tǒng)分型方法受限于MP基因序列保守性，只有包含少量的點(diǎn)突變的開放閱讀框架(Open readingframe，ORF)及MP管家基因、結(jié)構(gòu)基

2、因較難發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，故對MP區(qū)分度較低。多位點(diǎn)可變重復(fù)序列分析(Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA)是近年來發(fā)展起來的一種以PCR為基礎(chǔ)，根據(jù)所檢測的菌株基因序列中不同位點(diǎn)的、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(Variable-number tandem repeats，VNTR)的重復(fù)單元拷貝數(shù)的差異來進(jìn)行分子分型的技術(shù)。該分型方法可以將菌株分型變得更為細(xì)化，有利于臨

3、床診斷、治療及流行病學(xué)的監(jiān)測。
　　為建立MLVA分型體系并探討其臨床意義，本文采用MP感染兒童的口咽拭子(Oropharyngeal swabs，OP)進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，將所獲取的臨床菌株采用雙探針熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time polymerase chain reaction，real-timePCR)、基于P1黏附蛋白基因限制性酶切圖譜（Restriction fragment lengthpolymorphi

4、sm，RFLP）及MLVA進(jìn)行基因分型，旨在探討MP菌株不同MLVA亞型的流行狀況以及MLVA亞型與臨床的關(guān)系，闡明MP分子流行病學(xué)現(xiàn)狀，為臨床診斷及治療提供幫助。
　　方法:
　　(1)MLVA分型體系的建立:采用標(biāo)準(zhǔn)株及臨床樣本結(jié)合方法研究MP體外培養(yǎng)分離純化的最佳條件。使用標(biāo)準(zhǔn)菌株MP-M129和MP-FH研究real-time PCR及MLVA分型最佳反應(yīng)條件。
　　(2)MLVA分型臨床應(yīng)用:以2014年3月

5、-2015年4月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院發(fā)熱門診及住院患兒1131例和兩所正在流行MP感染小學(xué)的122名兒童的OP標(biāo)本進(jìn)行雙探針real-time PCR確定MP陽性，篩選后在自制MP瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)、分離、純化及保存，所取得菌株再進(jìn)行MLVA進(jìn)行基因分型及P1-RFLP對比。采集臨床資料統(tǒng)計(jì)分析MP的發(fā)熱率、平均發(fā)熱天數(shù)、最高體溫、激素使用率及病情輕重程度等指標(biāo)是否與MLVA基因型有關(guān)。
　　結(jié)果:
　　(1)雙探針

6、Real-time PCR及臨床所應(yīng)用的MP商用檢測試劑盒共檢出217例臨床MP陽性樣本，以MP商用檢測試劑盒為參照，雙探針Real-time PCR法敏感性為92.3％、特異性91.7％;
　　(2)MP體外培養(yǎng)、分離及純化得到MP菌株共164株，以雙探針Real-timePCR陽性為參照，分離率為66.67％(164/246)。其中來自門診或住院為146株，來自MP暴發(fā)流行兩所小學(xué)的有18株;
　　(3)146份門診或住

7、院MP樣本進(jìn)行了MLVA分型，結(jié)果為MLVAA型(13例)、MLVA B型（1例）、MLVA E型（36例）、MLVAH型（1例）、MLVAJ型（27例）、MLVA S型（1例）、MLVAP型（39例）、MLVA U型（20例）、MLVAX型（6例）。18份小學(xué)流行MP樣本分型結(jié)果為MLVA J型（5例）與U型(13例)，且同一所小學(xué)所流行的MP菌株為同一型。
　　(4)MLVA亞型的臨床資料比較分析發(fā)現(xiàn)，U型引起MP重癥感染比率