白氏文昌魚RAB1基因的克隆、原核表達與免疫功能分析.pdf

1、絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，可調控多種生物學過程。TGF-β激活激酶-1(TAK1)，也稱為絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)，最初是作為MAPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶被發(fā)現的。TAK1通過介導激活核因子κB(NF-κB)、c-Jun氮末端激酶(JNK)和p38通路來應對白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α和toll樣受體的刺激。TAB1（也就是TAK1結合蛋白）是蛋白激酶TAK1的

2、一個調節(jié)亞基，并且可以特異性的作用于TAK1氮末端從而直接誘導TAK1激酶活性。文昌魚在進化過程中作為無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡物種，位于脊索動物的底端，是研究脊椎動物免疫進化的重要材料。為了進一步的研究TAB1基因的功能和進化，本論文首次克隆了白氏文昌魚的TAB1基因，對該基因序列進行相關生物信息學分析，并且采用原核表達系統(tǒng)成功表達出了白氏文昌魚TAB1蛋白。通過實時熒光定量PCR技術檢測TAB1基因的時空表達模式。實驗結果如下:

3、
　　(1)采用RT-PCR和RACE-PCR技術克隆得到白氏文昌魚TAB1基因全長序列。TAB1基因全長為2281bp，其中ORF序列長度為1659bp，可編碼533個氨基酸，5'非翻譯區(qū)長度為89bp，3'非翻譯區(qū)長度為533bp。利用DNA重組技術構建了PET32a-TAB1表達載體，通過原核表達實驗，IPTG低溫誘導6h后成功表達出大小為62KDa的特異性蛋白，進一步利用Anti-His tag抗體采用Western bl

4、ot方法初步驗證該特異蛋白就是重組表達的TAB1蛋白。
　　(2)白氏文昌魚TAB1基因相關生物信息學分析表明:文昌魚TAB1蛋白序列與其它物種之間相似性高;文昌魚TAB1基因組由8個外顯子和7個內含子組成;文昌魚TAB1基因序列含有一個特異的PP2Cc結構域;與另外20個物種的TAB1氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹，結果表明白氏文昌魚TAB1位于無脊椎動物和脊椎動物之間且白氏文昌魚TAB1基因屬于TAB1基因家族。
　　(3)通

5、過實時熒光定量PCR技術檢測文昌魚TAB1基因在鰓、肝盲囊、腸、肌肉、脊索和性腺等6個不同組織中的表達量情況，結果表明文昌魚TAB1基因在各個組織中都有表達，且TAB1基因在性腺中的表達量最高，在肝盲囊、肌肉和脊索中的表達量相對較高，在鰓和腸中的表達量最低。采用實時熒光定量PCR技術檢測TAB1基因在LPS刺激后不同時間點(2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h和48h)的表達量情況。結果表明文昌魚TAB1基因在6h時的相對表達