牛奶、雞蛋過(guò)敏原的鑒定、純化及應(yīng)用研究.pdf

1、目的：食物過(guò)敏是當(dāng)今重大的衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題，食物過(guò)敏原的鑒定、純化、和標(biāo)準(zhǔn)化是食物過(guò)敏性疾病預(yù)防和治療的中心環(huán)節(jié)。本研究以牛奶、雞蛋中的過(guò)敏原為研究對(duì)象，以過(guò)敏患者血清中的特異性抗體為探針，對(duì)牛奶和雞蛋中的過(guò)敏原組分進(jìn)行鑒別，并設(shè)法將其純化，作為原料制備包被抗原和酶標(biāo)抗原，建立食物過(guò)敏的雙抗原夾心酶免疫檢測(cè)法，并對(duì)其臨床應(yīng)用性能進(jìn)行考察，為食物過(guò)敏診斷試劑的改善和國(guó)產(chǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴血清收集：從天津市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科收集

2、雞蛋、牛奶過(guò)敏的陽(yáng)性患者血清及正常對(duì)照血清。⑵牛奶/雞蛋過(guò)敏原組分的鑒定：提取牛奶/雞蛋中的總蛋白成分，經(jīng)SDS-PAGE觀(guān)察蛋白條帶，以牛奶/雞蛋過(guò)敏血清中的特異性抗體作為探針，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)鑒定其中的過(guò)敏原組分。⑶牛奶/蛋清過(guò)敏原組分的純化：在鑒定工作的的基礎(chǔ)上，通過(guò)去脂、等電點(diǎn)沉淀、鹽析、凝膠層析、超濾等手段設(shè)法對(duì)牛奶/蛋清中的蛋白進(jìn)行分離和純化，提取出主要的過(guò)敏原組分，并進(jìn)一步驗(yàn)證致敏性。⑷牛奶過(guò)敏特異性抗體的雙抗原夾心酶免疫

3、檢測(cè)法的建立：通過(guò)ELISA考察牛奶過(guò)敏原組分的致敏性，將其進(jìn)行合理配比制備包被抗原，同時(shí)對(duì)過(guò)敏原組分進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，制備酶標(biāo)抗原，建立雙抗原夾心法檢測(cè)模式，摸索最佳工作濃度和反應(yīng)條件。⑸雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)牛奶過(guò)敏特異性抗體的初步臨床應(yīng)用：以目前臨床應(yīng)用的進(jìn)口食物過(guò)敏檢測(cè)試劑作為參考方法，與本實(shí)驗(yàn)建立的雙抗原夾心法進(jìn)行比較，測(cè)定同一批臨床收集的血清標(biāo)本，計(jì)算檢測(cè)的靈敏度、特異度和陰陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，比較二者檢測(cè)結(jié)果的符合率，對(duì)本

4、研究建立的方法的臨床應(yīng)用效果進(jìn)行考察。
　　 結(jié)果：①牛奶過(guò)敏原組分的鑒定：在牛奶總蛋白粗提液中觀(guān)察到約9個(gè)主要蛋白條帶；鑒定出其中18kd、14kd、28kd、及70kd附近的多個(gè)條帶出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，推測(cè)依次為β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白、以及包括牛血清白蛋白在內(nèi)的多個(gè)大分子蛋白組分。②雞蛋過(guò)敏原組分的鑒定：在蛋清總蛋白粗提液中觀(guān)察到約4個(gè)主要蛋白條帶，蛋黃總蛋白粗提液中觀(guān)察到10個(gè)主要條帶；鑒定出蛋清中分子量大約為78k

5、d、43kd、28kd、14kd的多個(gè)條帶出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，判斷為卵清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白、卵類(lèi)黏蛋白和溶菌酶；在蛋黃中檢測(cè)到更多的顯色條帶，但在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了明顯的非特異顯色。③牛奶、蛋清過(guò)敏原組分的純化；通過(guò)脫脂、等電點(diǎn)沉淀、凝膠層析、離子交換層析等手段，先后從牛奶中純化出酪蛋白、大分子蛋白組分(P1)、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白4個(gè)過(guò)敏原組分，建立了一套完善的純化工藝；從蛋清中純化出卵類(lèi)黏蛋白一個(gè)單一組分及數(shù)個(gè)部分純化組分。④過(guò)敏原的標(biāo)記

6、及致敏性考察：用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記了四種牛奶過(guò)敏原組分，并通過(guò)單一過(guò)敏原組分的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙抗原夾心法的陽(yáng)性率明顯高于間接法，而四種過(guò)敏原中，β-乳球蛋白和P1組分的陽(yáng)性率較高。⑤牛奶過(guò)敏特異性抗體的雙抗原夾心酶免疫檢測(cè)法的建立及條件優(yōu)化：根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定配比抗原中各組分的比例為P1：β-乳球蛋白：α-乳白蛋白：酪蛋白=30％：40％：20％：10％，復(fù)合酶標(biāo)抗原中P1、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白的比例依次為1:150

7、0、1:12000、1:6000和1:6000。最佳包被濃度為50μg/ml，最佳反應(yīng)時(shí)間為1h，最佳血清用量為10μ l。⑥雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)牛奶特異性抗體的初步臨床應(yīng)用：用本實(shí)驗(yàn)建立的雙抗原夾心法ELISA檢測(cè)模式和德國(guó)MEDIWISS Analytic GmbH公司的IVTAllergen Screen食物過(guò)敏檢測(cè)試劑盒同時(shí)測(cè)定一批臨床血清，通過(guò)比較二者的測(cè)定結(jié)果得出該方法的靈敏度為91.304％，特異度為94.286％，陽(yáng)

8、性預(yù)測(cè)值(PPV)為91％，陰性預(yù)測(cè)值為94％，同參考方法有較高的符合率。
　　 結(jié)論：⑴鑒定出牛奶中的多個(gè)過(guò)敏原組分，并成功地從牛奶中純化出4個(gè)過(guò)敏原組分，摸索出一套完善的牛奶過(guò)敏原純化工藝。⑵鑒定出蛋清中的多種過(guò)敏原組分，在鑒定蛋黃中過(guò)敏原的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)非特異反應(yīng)，成功地從蛋清中純化出一種單一過(guò)敏原組分，蛋清過(guò)敏原的純化方法有待進(jìn)一步改進(jìn)。⑶對(duì)牛奶過(guò)敏原進(jìn)行了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，建立了牛奶過(guò)敏的雙抗原夾心酶免疫檢測(cè)方法，并確定