兩種節(jié)肢動物過敏原的分離純化及結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、昆蟲叮咬是引起速發(fā)型過敏反應(yīng)的三大因素之一（其它兩類因素為食物和藥物）。通過叮咬能引起速發(fā)型過敏反應(yīng)的昆蟲有蜜蜂、胡蜂、牛虻、蚊子、蟻等。被昆蟲叮咬后所引發(fā)的速發(fā)型過敏反應(yīng)，由于病人未就診，醫(yī)生未報道及不同的診斷標準，其真正發(fā)生率很難計算。盡管如此，其被記載的發(fā)生率還在不斷增加。來自美國羅切斯特流行病學(xué)項目的報告，昆蟲叮咬引起的速發(fā)型過敏反應(yīng)人群發(fā)生率從上世紀八十年代的十萬分之二十一增至目前的十萬分之五十，其它研究也得出相似的結(jié)果。同時

2、這些昆蟲過敏原之間還存在不同程度的交叉過敏反應(yīng)，常見的交叉過敏反應(yīng)有蜜蜂蚊子交叉反應(yīng)，蜜蜂胡蜂過敏原交叉反應(yīng)，以及本研究所證實的胡蜂牛虻綜合征。這些昆蟲之間的交叉過敏反應(yīng)使得昆蟲叮咬引起的速發(fā)型過敏反應(yīng)的發(fā)生率呈倍數(shù)增長，且為這類速發(fā)型過敏反應(yīng)的診治帶來較大困難。我們實驗室前期研究工作顯示牛虻的唾液腺及胡蜂的毒素富含多種具有生物活性的物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)對牛虻從宿主獲得血餐及胡蜂捕食和自衛(wèi)有重要意義。被牛虻和胡蜂叮咬的人常會有局部的紅

3、腫、灼痛，嚴重的可表現(xiàn)為皮膚大面積蕁麻疹，血管性水腫，支氣管痙攣，主支氣管水腫等過敏反應(yīng)癥狀，甚至是過敏性休克而危及生命。但在此之前尚無牛虻過敏原的報道，對胡蜂毒素過敏原的報道也相對較少。在叮咬能引起人體過敏的昆蟲中，牛虻和胡蜂個體相對較大，分泌過敏原的唾液腺和毒腺富含唾液和毒素，在叮咬人時，可將這些唾液及毒素注入人體內(nèi)，且唾液和毒素中的其它活性成分如蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、抗凝血物質(zhì)等也有助于過敏原在機體內(nèi)的擴散，進而更易作用于免疫細胞如

4、抗原遞呈細胞等，這些因素會導(dǎo)致牛虻和胡蜂叮咬引發(fā)的過敏反應(yīng)癥狀更為嚴重。
　　 在本研究中，通過解剖牛虻唾液腺及收集胡蜂毒素，整合色譜層析和免疫雜交等技術(shù)共從牛虻唾液腺和胡蜂毒素中分離純化鑒定了5種新的過敏原，它們分別是Taby1、Vespma1、Vespma2、Vespma4和Vespma5。其中Taby1是一種分子量約為70kDa的Apyrase，它可以水解ATP生產(chǎn)AMP和雙磷酸。Vespma1、Vespma2、Vespm

5、a4和Vespma5分別為34kDa的磷脂酶A、35kDa的透明質(zhì)酸酶、28kDa的絲氨酸蛋白酶和25kDa的抗原-5蛋白。運用Edman降解和cDNA克隆技術(shù)獲得了它們?nèi)L氨基酸序列。通過皮膚針刺實驗(Skinpricktest)發(fā)現(xiàn)對牛虻過敏的病人中有約71％對Taby1呈陽性，Vespma5和Vespma2對胡蜂毒素過敏病人的陽性反應(yīng)率分別為73％和80％。通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)Taby1對采集的37份牛虻過敏病人血清

6、IgE的陽性率為81％，Vespma5和Vespama2對蜂中毒過敏病人血清的IgE的陽性反應(yīng)率為91.0％和93.9％，對牛虻過敏病人血清IgE陽性反應(yīng)率也高達86.5％和91.8％。通過Elisacompetitiveinhibition發(fā)現(xiàn)，Taby1可以劑量依賴的方式競爭性抑制病人血清IgE與牛虻唾液腺總蛋白的結(jié)合，最大抑制率可達42％左右，Vespma5和Vespma2對蜂毒粗樣與蜂中毒過敏病人血清IgE結(jié)合的最大抑制率分別為

7、39.5％和39.4％，對牛虻唾液腺粗樣與牛虻過敏病人血清IgE結(jié)合的最大抑制率分別為25.3％和23.8％。嗜堿性細胞活化檢測(Basophilactivationtest)顯示，Taby1可以有效地誘導(dǎo)牛虻過敏病人外周血嗜堿性細胞CD63的表達，濃度1.0μg/mlTaby1作用后，CD63和CCR3雙陽性細胞數(shù)是陰性對照的4.9倍。同時Taby1還具有較強的抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集活性，在濃度為230ng/ml和460ng/ml對

8、血小板聚集的抑制率可達80％和100％。利用鼠動靜脈支路血栓模型(RAST)和角叉菜膠誘導(dǎo)的鼠尾血栓模型(MTT)，發(fā)現(xiàn)Taby1可以呈劑量依賴地抑制血栓形成。同時，Westernblot結(jié)果顯示，我們先前從牛虻唾液腺發(fā)現(xiàn)的兩類主要過敏原Taby5和Taby2與蜂毒過敏病人血清IgE陽性反應(yīng)率分別可達81.8％和78.8％，Elisacompetitiveinhibition顯示所以Taby5和Taby2能劑量依賴地抑制蜂毒粗樣與蜂毒過

9、敏病人血清IgE的結(jié)合。所以以上結(jié)果說明Taby1、Vespma5和Vespma2分別是牛虻唾液腺和胡蜂毒素的主要過敏原，且Taby2、Taby5、Vespma2和Vespma5在胡蜂牛虻交叉過敏反應(yīng)中起重要作用。
　　 在本研究及前期研究中，我們從牛虻唾液腺和胡蜂毒素中分別鑒定了3種和4種過敏原，這些過敏原構(gòu)成了牛虻唾液腺和胡蜂毒素的過敏原主要成分。這些結(jié)果豐富了我們對牛虻唾液腺及胡蜂毒素過敏原組成成分的認識，為牛虻、胡蜂及其