谷胱甘肽對凡納濱對蝦氧化酶的調(diào)控機(jī)理.pdf

1、凡納濱對蝦(Litopenaeus Vannamei)是世界上最優(yōu)良的蝦類養(yǎng)殖品種,在我國沿海地區(qū)已進(jìn)行了大規(guī)模的人工養(yǎng)殖,目前是我國對蝦的主導(dǎo)養(yǎng)殖品種和重要的出口水產(chǎn)品之一。但在集約化養(yǎng)殖過程中,對蝦面臨著大量的應(yīng)激因素(如:擁擠、營養(yǎng)、環(huán)境、代謝等)。激烈的應(yīng)激往往會引起對蝦抗病力減弱,疾病爆發(fā)和流行,導(dǎo)致養(yǎng)殖者過度使用獸藥和抗生素飼料添加劑。長期、大量使用抗生素會造成對蝦腸道內(nèi)菌群失調(diào),破壞微生態(tài)環(huán)境,產(chǎn)生藥物殘留。藥物殘留會導(dǎo)致

2、人類過敏反應(yīng)、免疫抑制、致畸、致癌、致突變等。近幾年我國發(fā)生了多起食品安全的重大事件,嚴(yán)重地挫傷了消費(fèi)者的信心。隨著國際貿(mào)易中綠色壁壘的逐漸加強(qiáng),我國農(nóng)產(chǎn)品特別是水產(chǎn)品出口受到的影響越來越大,所有這些嚴(yán)重威脅著我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此,抗生素替代品的研究與開發(fā)已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。研制高效安全的抗氧化飼料添加劑,通過營養(yǎng)調(diào)控提高或激活對蝦自身的抗氧化防御能力,是解決上述難題的有效的新途徑之一。
　　 本論文以凡納濱對蝦為

3、研究對象,通過“體內(nèi)”(in vivo)和“體外”(in vitro)實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)研究了還原型谷胱甘肽(GSH)對凡納濱對蝦生長性能、抗氧化系統(tǒng)以及非特異免疫因子的影響；對凡納濱對蝦原代培養(yǎng)肝胰腺細(xì)胞的增殖、生理生化功能以及相關(guān)抗氧化酶的影響；并從分子水平上揭示了GSH在凡納濱對蝦上的抗氧化機(jī)理。本論文主要包括如下四個(gè)部分:
　　 1.凡納濱對蝦組織抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量對氨氮脅迫的反應(yīng)特點(diǎn)本文選擇南方有代表性的凡納濱對

4、蝦(Litopenaeus vannamei)(初始體重為6.322±0.221g),分別測定了凡納濱對蝦在氨氮脅迫前后,腮絲、肌肉、肝胰腺和血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和GSH、丙二醛(MDA)含量以及機(jī)體總抗氧化能力(T-AOC)的變化情況。
　　 結(jié)果顯示,經(jīng)離子銨氮脅迫后,凡納濱對蝦鰓絲中除GSH-Px(P<0.05,)外,肌肉中除SOD(P<0.05)外,

5、其它各抗氧化酶活性、T-AOC、GSH和MDA含量,在脅迫前后變化不大；在肝胰腺中,除T-AOC外,各項(xiàng)指標(biāo)和脅迫前相比,有顯著的變化(P<0.05)；在血清中,SOD、GSH-Px和MDA含量在氨氮脅迫前后有顯著差異(P<0.05)。其中肝胰腺中CAT、GSH,血清中GSH-Px活性與脅迫前相比,差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明,血清和肝胰腺是凡納濱對蝦對銨氮造成脅迫的敏感組織,抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px、總抗氧化能力和

6、MDA含量可作為衡量凡納濱對蝦氧化應(yīng)激狀態(tài)的敏感指標(biāo)。
　　 2.谷胱甘肽對凡納濱對蝦生長性能、抗氧化和非特異免疫功能的影響在基礎(chǔ)日糧中分別添加0、60、120、180、240和300mg/kg還原型谷胱甘肽(GSH),飼喂初始平均體重(initial body weight,IBW)為1.123±0.007g凡納濱對蝦(litopenaeusvannamei)(分別記為G0、G60、G120、G180、G240和G300組),

7、研究飼料中添加GSH對凡納濱對蝦生長性能、機(jī)體抗氧化水平、脂質(zhì)過氧化物含量和非特異免疫功能的影響。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周。停止喂料24 h后,全部稱重,統(tǒng)計(jì)耗料、死亡。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取15只蝦,取樣。剩余部分放回原循環(huán)系統(tǒng),加入20mg/L濃度的氯化銨處理1周,停止循環(huán)水,試驗(yàn)各組繼續(xù)投喂試驗(yàn)飼料,第9周末,停喂24h后,統(tǒng)計(jì)成活率,取樣。
　　 試驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　 (1)飼料中添加GSH能顯著提高凡納濱對蝦的增重率、成活率和

8、飼料轉(zhuǎn)化效率。試驗(yàn)各組凡納濱對蝦成活率較對照組提高8.53％-31.69(P<0.05);增重率隨GSH添加量的增加而增加,當(dāng)添加量為180mg/kg時(shí)達(dá)到高峰；隨著GSH添加量的進(jìn)一步增加,增重率呈下降趨勢(p<0.05)。飼料中GSH添加量不低于120 mg/kg時(shí),顯著地降低餌料系數(shù)(p<0.05)；飼料中添加GSH提高了凡納濱對蝦血清、肝胰腺和肌肉中的蛋白濃度。當(dāng)GSH添加量不低于180mg/kg時(shí),血清及肝胰腺蛋白濃度顯著高于

9、對照組(p<0.05)；肌肉蛋白濃度在GSH添加量180 mg/kg時(shí)達(dá)到最高(p<0.05)；鰓絲蛋白濃度試驗(yàn)各組差異不顯著(p>0.05)；試驗(yàn)各組凡納濱對蝦的血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于對照組(p<0.05),且與GSH添加量呈劑量.效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)飼料中GSH的添加量分別60、120和180 mg/kg時(shí),凡納濱對蝦肝胰腺中GSH濃度顯著升高(p<0.05)。以增重率為評價(jià)指標(biāo),GSH在凡納濱對蝦飼料中的適宜添加量為174.13 mg/

10、kg。
　　 (2)飼料中添加一定量的GSH能提高凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化能力和降低脂質(zhì)過氧化物含量。飼料GSH能顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺中抗氧化酶活性(P<0.05):其中120 mg/kg、180 mg/kg和300 mg/kg組的SOD活性,120 mg/kg、180 mg/kg和240 mg/kg組的GSH-Px活性,60 mg/kg、120 mg/kg組的GR活性,顯著高于對照組(P<0.05);各試驗(yàn)組肝胰腺中GSH含

11、量和總抗氧化能力T-AOC比對照組分別提高了8.93％-52.57％和3.02％-37.03％,且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。隨著飼料GSH含量的升高,肝胰腺氧自由基(ROS)和脂質(zhì)過氧化物MDA的含量呈下降趨勢,分別在添加量為240 mg/kg和300 mg/kg時(shí)達(dá)到最低,且顯著低于對照組(P<0.05)。對蝦成活率和肝胰腺抗O2能力,均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,各項(xiàng)指標(biāo)分別在120mg/kg、180 mg/kg組達(dá)到最高值,并顯著

12、高于對照組(P<0.05)。
　　 (3)在凡納濱對蝦的肝胰腺中,髓過氧化物酶(MPO)、溶菌酶(LSZ)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性隨著飼料中GSH添加量的增加,均呈先升后降的趨勢,在120-240 mg/kg之間達(dá)到最高值,且顯著高于對照組(p<0.05),但隨著GSH量繼續(xù)增加(高于240 mg/kg時(shí)),各種酶的活性急劇下降。而在血清中,LSZ、AKP和ACP活性先隨飼料GSH添加量的增加而增加,分別

13、在180 mg/kg、240 mg/kg和240mg/kg達(dá)到最高值,然后急劇下降。血清和肝胰臟中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)呈下降趨勢,在240 mg/kg組達(dá)到最低,且顯著低于對照組(P<0.05),但在300 mg/kg組又有所回升。凡納濱對蝦經(jīng)過離子銨脅迫1周后,發(fā)現(xiàn)一定添加量的GSH能提高氨氮脅迫凡納濱對蝦成活率,并對免疫因子有積極的影響。但不同的免疫因子,在不同組織敏感程度不一樣,作用劑量不同

14、。從本試驗(yàn)結(jié)果看,血清和肝胰腺中的LSZ、AST/GOT、ALT/GPT、ACP都是能反應(yīng)凡納濱對蝦非特異免疫因子的敏感指標(biāo),與成活率結(jié)果比較一致；而MPO和肝胰腺中的AKP相對而言,規(guī)律性不強(qiáng)。
　　 由上述可見,飼料中添加一定量的GSH能顯著提高凡納濱對蝦的生長性能,提高凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化能力和降低脂質(zhì)過氧化物含量,有效提高凡納濱對蝦血清和肝胰腺中髓過氧化物酶、溶菌酶和磷酸酶活性,影響轉(zhuǎn)氨酶的活性,并影響凡納濱對蝦機(jī)體的

15、免疫因子水平,從而激發(fā)凡納濱對蝦的非特異免疫功能,提高凡納濱對蝦成活率,改善離子銨對凡納濱對蝦造成的氧化脅迫。
　　 3.凡納濱對蝦肝胰腺線粒體脂質(zhì)過氧化模型建立與GSH的抗氧化損傷作用首先,建立凡納濱對蝦肝胰腺線粒體的制備方法。采用三種不同的差速離心法,提取凡納濱對蝦肝胰腺線粒體,用中性紅一詹納斯綠B(Jana’s green B)染色鑒定,以O(shè)D260/OD280比值檢查線粒體純度。第二,建立凡納濱對蝦肝胰腺線粒體氧化損傷模

16、型。分別用VC/FeSO4、NADH來誘導(dǎo)線粒體氧化,并確定各種催化劑的反應(yīng)濃度,篩選反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)條件,建立兩種誘導(dǎo)凡納濱對蝦肝胰腺線粒體的氧化模型。第三,研究GSH對凡納濱對蝦線粒體氧化損傷的抑制作用。在所建立的線粒體氧化損傷模型中加入不同濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mmol/L)的GSH,以反應(yīng)體系中MDA含量、線粒體膨脹度和DNA雙鏈百分比為指標(biāo)來觀察GSH對線粒體脂質(zhì)過氧化的抑制效果。研究結(jié)果顯示:

17、>　　 (1)凡納濱對蝦肝胰腺線粒體制備方法為:按肝胰腺(鮮重):緩沖液=1:15加入緩沖液STE(mmol/L:Sucrose250,Tis-HCl10,EDTA1,pH8.0)進(jìn)行勻漿,4℃1000g離心15min；4℃10000g離心20min,用緩沖液STM(mmol/L:Sucrose250,Tris-HCl50,MgCl25,pH7.4)重懸浮純化,中性紅-詹納斯綠B染色,高倍鏡觀察為亮綠色,OD260/OD280=1.7

18、3。
　　 (2)建立的VC/FeSO4氧化模型為:在線粒體蛋白濃度1mg/ml,VC濃度0.2mmol/L,FeSO4濃度4μmol/L,pH7.4HEPES緩沖體系中,30℃,經(jīng)30min反應(yīng)。當(dāng)外源GSH添加濃度為0.4mmol/L時(shí),對線粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用最顯著。建立的NADH模型為:線粒體蛋白濃度1.0mg/ml,FeCl30.04mmol/L,ADP4.0mmol/L,在25mmol/L HEPES/NaOH緩

19、沖液pH7.4(含0.15mol/LKCl)條件下,加入NADH120μmol/L啟動(dòng)反應(yīng),30℃水浴,振蕩30min后加入20％三氯乙酸終止反應(yīng)。當(dāng)外源GSH添加濃度為0.4mmol/L時(shí),對線粒體的保護(hù)效果最好。
　　 (3)通過對VC/FeSO4和NADH模型的比較發(fā)現(xiàn),兩種模型都能顯著(P<0.05)激發(fā)凡納濱對蝦肝胰腺線粒體的脂質(zhì)過氧化,二者之間差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比,兩個(gè)模型MDA含量分別為2.10

20、倍和1.43倍,線粒體膨脹度分別為1.71倍和1.38倍,DNA雙鏈百分比分別是60.07％和55.13％。從MDA和線粒體膨脹度來看,NADH模型的效果更好；以DNA雙鏈百分比作為指標(biāo),VC/FeSO4模型效果更佳。
　　 4.凡納濱對蝦肝胰腺細(xì)胞原代培養(yǎng)、谷胱甘肽對細(xì)胞生長、生理生化和抗氧化功能以及抗氧化酶mRNA表達(dá)量的影響首先建立凡納濱對蝦肝胰腺細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。第二,研究GSH對細(xì)胞增殖、生理生化和抗氧化功能的影響。用

21、含有不同濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mmol/L)GSH的培養(yǎng)基對凡納濱對蝦肝胰腺細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),分別在第24h、48h和72h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,測定離體肝胰腺細(xì)胞的活力、RNA/DNA比、白蛋白含量、一氧化氮合酶(NOS)、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF—Ⅰ)、ATPase、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)活性。分別在第24h、48h和72h收集細(xì)胞,勻漿后,測定細(xì)胞勻漿上清液中SO

22、D、GSH-Px、CAT活性、MDA和H2O2含量。第三,研究GSH對離體肝胰腺細(xì)胞SOD和CATmRNA表達(dá)量的影響。收集原代培養(yǎng)72h的肝胰腺細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA,測定SODmRNA和CATmRNA表達(dá)量。
　　 結(jié)果如下:
　　 (1)建立的凡納濱對蝦肝胰腺細(xì)胞原代培養(yǎng)方法為:采用高錳酸鉀浸泡、冰冷滅菌PBS溶液沖洗、75％乙醇體表消毒后取出肝胰腺,用0.05％Ⅱ型膠原酶27℃消化10min,低溫離心(1200r/

23、min,10 min；1000r/min,5min),27℃、5％CO2和飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)(接種密度:5×105個(gè)細(xì)胞/ml)。72 h后,細(xì)胞狀態(tài)良好,外表光滑,折光性好,經(jīng)測定細(xì)胞活性高。
　　 (2)GSH能促進(jìn)凡納濱對蝦離體肝胰腺細(xì)胞增殖、提高RNA/DNA比,促進(jìn)IGF—Ⅰ分泌,表明GSH能通過對生長有關(guān)激素的調(diào)控來促進(jìn)細(xì)胞的生長,GSH除了本身的抗氧化功能外,還具有營養(yǎng)作用。GSH能促進(jìn)離體肝胰腺細(xì)胞白蛋白和NOS

24、酶分泌,提高體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的生物活性。能通過提高ATPase活性,保護(hù)細(xì)胞膜通透性,維持膜的正常生理功能。
　　 (3)培養(yǎng)72h后,添加GSH對抗氧化酶和MDA含量等的影響分別為:明顯提高肝胰腺細(xì)胞勻漿中SOD活性,呈現(xiàn)先升后降,最后上升趨于平穩(wěn),除1.2 mmol/L組外,試驗(yàn)各組分別比對照組提高了17.28％、9.05％、37.04％和45.27％,其中0.8mmol/L組達(dá)到顯著水平(P<0.05);各試驗(yàn)組GSH-Px

25、活性均高于對照組,但試驗(yàn)各組組間差異不顯著(P>0.05); MDA含量除1.2 mmol/L組外,試驗(yàn)各組均顯著低于對照組(P<0.05),在0.2 mmol/L組達(dá)到最低水平；H2O2含量在各試驗(yàn)組顯著降低,各組依次降低了4.42％、17.85％、10.22％、25.58％和16.48％,其中試驗(yàn)0.8 mmol/L組能達(dá)到顯著水平(P<0.05)。
　　 (4)添加GSH明顯提高凡納濱對蝦離體肝胰腺細(xì)胞SODmRNA表達(dá)量

26、,除0.1mmol/L組外,各試驗(yàn)組的SODmRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組(p<0.05)。與對照組相比,除1.2 mmol/L組外,添加GSH各組肝胰腺細(xì)胞CATmRNA的表達(dá)量均有所升高(p>0.05)。結(jié)果表明,GSH能提高離體肝胰腺細(xì)胞中SOD酶活力,降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量,影響SOD和CATmRNA的表達(dá)。
　　 5.結(jié)論
　　 1)GSH在體內(nèi)能改善凡納濱對蝦的生長性能,提高飼料轉(zhuǎn)化效率和存活率,提高對蝦機(jī)

27、體的抗氧化水平和抗氧化能力,緩解離子銨引起的氧化應(yīng)激。以增重率為評價(jià)指標(biāo),GSH在凡納濱對蝦飼料中的適宜添加量為174.13 mg/kg。
　　 2)GSH在體外能抑制凡納濱對蝦肝胰腺線粒體的脂質(zhì)過氧化,當(dāng)GSH添加濃度為0.4mmol/L時(shí),對線粒體的保護(hù)效果最好。外源GSH促進(jìn)了離體肝胰腺原代培養(yǎng)細(xì)胞的生長、增殖,提高原代培養(yǎng)肝胰腺細(xì)胞的生物活性。能通過調(diào)節(jié)與生長代謝相關(guān)的酶和抗氧化酶的活性,降低MDA含量來保護(hù)細(xì)胞膜通透性