兩種泥鰍SoxE亞族和DMRT1基因的結(jié)構(gòu)與功能分析.pdf

1、本文利用RACE方法克隆得到了兩種泥鰍SoxE亞族全部成員基因和大鱗副泥鰍DMRT1基因,并利用半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR對各個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究,為了更進(jìn)一步確定目的基因的表達(dá)部位,我們利用RNA原位雜交法分別對兩種泥鰍的性腺和不同發(fā)育時(shí)期的胚胎進(jìn)行了雜交,主要研究結(jié)果包括下面三個(gè)方面:
　　 1.泥鰍SoxE亞族基因的克隆和表達(dá)模式分析
　　 本研究根據(jù)其它物種Sox8和Sox10基因HMG保守區(qū)

2、序列,設(shè)計(jì)兩對簡并引物,并在此基礎(chǔ)上采用RACE方法從泥鰍腦中分離得到了SoxE亞族各成員cDNA全序列:MaSox8a基因cDNA全長為2555bp,包括53bp5'非翻譯區(qū),1212bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼429個(gè)氨基酸的開放閱讀框(基因注冊號為GU166139);MaSox8b基因cDNA全長為1725bp,包括85bp5'非翻譯區(qū),395bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼414個(gè)氨基酸的開放閱讀框(基因注冊號為

3、GU166140);MaSox9a基因cDNA全長為3192bp,包括326bp5'非翻譯區(qū),1408bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼485個(gè)氨基酸的開放閱讀框;MaSox9b基因的cDNA全長為1782bp,包括217bp5'非翻譯區(qū),179bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼462個(gè)氨基酸的開放閱讀框;MaSox10基因的cDNA全長為2096bp,包括311bp5'非翻譯區(qū),312bpY非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼490

4、個(gè)氨基酸的開放閱讀框。
　　 半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示:在泥鰍胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,MaSox8a和MaSox8b的表達(dá)趨勢相反但是都從原腸胚開始一直持續(xù)到卵黃吸盡期,MaSox9a和MaSox9b的表達(dá)量都逐漸升高,在孵出期期表達(dá)量最高,MaSox10的表達(dá)量逐漸增加,孵出期達(dá)到最高;在泥鰍成體的不同組織中,SoxE亞族各個(gè)基因都廣泛存在,MaSox8a和MaSox8b在腦中的表達(dá)量較高,MaSox9a和

5、MaSox9b在性腺中表達(dá)量最高,Sox10在心臟中表達(dá)量最高。
　　 原位雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示:SoxE亞族的五個(gè)成員都在泥鰍未成熟的生殖細(xì)胞(卵巢的卵原細(xì)胞、初級卵母細(xì)胞,精巢中的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞)中表達(dá),因此推測SoxE亞族的五個(gè)成員可能調(diào)控泥鰍性腺的發(fā)育和分化;整體胚胎雜交發(fā)現(xiàn),SoxE亞族的五個(gè)成員均在體節(jié)形成期的體節(jié)中大量表達(dá),之后一直到尾芽期的胚胎脊柱中都有很強(qiáng)的陽性雜交信號,孵出期以后SoxE亞族的五個(gè)成員的表達(dá)主

6、要集中在泥鰍的脊柱、體節(jié)和頭部。
　　 2.大鱗副泥鰍SoxE亞族基因的克隆和表達(dá)模式分析
　　 本研究根據(jù)其它物種Sox8和Sox10基因HMG保守區(qū)序列,設(shè)計(jì)兩對簡并引物,并在此基礎(chǔ)上采用RACE方法從泥鰍腦中分離得到了SoxE亞族各成員cDNA全序列:PdSox8a基因cDNA全長為2467bp,包括53bp5'非翻譯區(qū),1127bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼428個(gè)氨基酸的開放閱讀框;PdSox8b基因c

7、DNA全長為2166bp,包括201bp5'非翻譯區(qū),720bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼414個(gè)氨基酸的開放閱讀框;PdSox9a基因cDNA全長為3232bp,包括329bp5'非翻譯區(qū),1439bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼487個(gè)氨基酸的開放閱讀框;PdSox9b基因的cDNA全長為1946bp,包括219bp5'非翻譯區(qū),341bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼461個(gè)氨基酸的開放閱讀框;PdSox10基因

8、的cDNA全長為2053bp,包括312bp5'非翻譯區(qū),262bp3'非翻譯區(qū)(含polyA)和編碼492個(gè)氨基酸的開放閱讀框。
　　 半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示:在大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,PdSox8a、PdSox8b、PdSox9b和PdSox10的表達(dá)量都逐漸下降,PdSox9a的表達(dá)量則相反呈現(xiàn)上升趨勢;在大鱗副泥鰍成體的不同組織中,SoxE亞族各個(gè)基因中廣泛存在,并且都在性腺中大量表達(dá),除

9、此之外PdSox8a在腦中的表達(dá)量也很高,PdSox8b、PdSox9a和PdSox9b在肝中的表達(dá)量均較高,PdSox10在心臟中表達(dá)量高。
　　 SoxE亞族的五個(gè)成員在大鱗副泥鰍性腺和胚胎中的原位雜交試驗(yàn)結(jié)果與泥鰍的一致。
　　 3.大鱗副泥鰍DMRT1基因的選擇性剪接和時(shí)空表達(dá)模式分析
　　 本研究根據(jù)其它物種DMRT1基因DM保守區(qū)序列,設(shè)計(jì)一對簡并引物,并在此基礎(chǔ)上采用RACE方法獲得了大鱗副泥鰍DM

10、RT1基因的cDNA全長。結(jié)果表明:在大鱗副泥鰍中DMRT1基因存在選擇性剪接。大鱗副泥鰍中得到五條DMRT1基因,分別命名為PdDMRTla1(1903bp)、PdDMRTla2(1714bp)、PdDMRTla3(887bp)、PdDMRTlb(724bp)和PdDMRTlc(946bp),它們也都含有DM基序和polyA尾。其中PdDMRTla1～3具有相同的開放閱讀框,包含5個(gè)完整的外顯子,編碼267個(gè)氨基酸,其差異主要在于3'

11、非翻譯區(qū)長度和序列不同;PdDMRTlb缺失了第四個(gè)外顯子3'末端的9bp和第五個(gè)外顯子,編碼220個(gè)氨基酸;PdDMRTlc則同時(shí)缺失了第四和第五個(gè)外顯子,并利用一段長63bp的額外序列在其編碼框末端充當(dāng)?shù)谖鍌€(gè)外顯子,編碼196個(gè)氨基酸。
　　 半定量RT-PCR、熒光定量RT-PCR和原位雜交技術(shù)用于檢測大鱗副泥鰍DMRT1基因在成體不同組織和胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)譜。結(jié)果表明:大鱗副泥鰍DMRT1基因只在精巢中強(qiáng)烈表達(dá),而

12、在卵巢中不表達(dá)或只有極微弱表達(dá),這與其它物種中的研究結(jié)果相一致;在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期大鱗副泥鰍DMRT1基因均有表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度又各不相同,呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢。由此,推斷大鱗副泥鰍的DMRT1與雄性性腺分化和發(fā)育具有明顯的相關(guān)性。這些結(jié)果為闡述DMRT1在脊椎動物體內(nèi)對性別決定和性別分化的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 綜上所述本研究結(jié)果證明:1.兩種泥鰍SoxE亞族至少由五個(gè)成員組成:Sox8a、Sox8b、Sox9a、Sox

13、9b和Sox10;2.本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)在兩種泥鰍中Sox8基因都具有兩個(gè)亞型Sox8a和Sox8b,目前僅發(fā)現(xiàn)河豚Sox8基因具有以上兩種亞型,其它物種中未見到相關(guān)報(bào)道;3.兩種泥鰍中Sox9基因也都具有兩個(gè)拷貝Sox9a和Sox9b,而Sox10基因只存在一個(gè)拷貝,這與部分己報(bào)道的物種一致;4.我們發(fā)現(xiàn)大鱗副泥鰍的DMRT1基因存在選擇性剪接;5.本實(shí)驗(yàn)首次利用多種檢測方法對各個(gè)目的基因的表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)研究。SoxE亞族各成員之間存