兩種典型OPFRs對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性及其機(jī)制探究.pdf

1、隨著世界范圍內(nèi)溴代阻燃劑的廣泛禁用，有機(jī)磷酸酯類阻燃劑的使用量大幅增加，這些阻燃劑作為添加劑加入到人類生產(chǎn)生活各種產(chǎn)品中，經(jīng)過滲透、磨損逐漸滲入到周圍環(huán)境中，對(duì)人類和野生動(dòng)物產(chǎn)生危害。科學(xué)家們對(duì)有機(jī)磷酸酯類阻燃劑進(jìn)行調(diào)查研究，在水、土壤、魚類、鳥類體內(nèi)檢測(cè)到了各種濃度范圍的有機(jī)磷酸酯類阻燃劑，且發(fā)現(xiàn)其具有內(nèi)分泌和甲狀腺毒性，但對(duì)其神經(jīng)毒性及其機(jī)制的研究尚少。本課題選取磷酸三（2，3-二氯丙基）酯(tris(2，3-dichloropro

2、pyl)phosphate，TDCPP)和三（2-羧乙基）磷(tris(2-carboxyethyl) phosphine，TCEP)兩種典型有機(jī)磷酸酯類阻燃劑為研究材料，以PC12神經(jīng)元細(xì)胞為模型，開展了TDCPP和TCEP的神經(jīng)毒性研究，并初步探索其可能的神經(jīng)毒性作用生物分子機(jī)制。
　　以NGF刺激分化的PC12細(xì)胞為體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞模型，選用暴露濃度為0-75μM的TDCPP和0-400μM的TCEP，分別對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行

3、0-6天的染毒處理。采用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，利用MTT法對(duì)細(xì)胞生存率進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)Ca2+改變進(jìn)行熒光檢測(cè);采用Western-Blotting(WB)技術(shù)對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白(如CaMK2、GAP43、tubulin、NF-H)，以及MAPK信號(hào)通路蛋白及其磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)和分析。并采用CaMK2蛋白抑制劑KN93抑制CaMK2活化后檢測(cè)MAPK通路磷酸化水平的改變，以期進(jìn)一步揭

4、示MAPK通路與CaMK2蛋白磷酸化之間的關(guān)系。研究分為三個(gè)部分，培養(yǎng)細(xì)胞分組及主要研究結(jié)果如下：
　　一、TDCPP/TCEP染毒PC12細(xì)胞導(dǎo)致其神經(jīng)毒性
　　檢測(cè)TDCPP暴露下PC12細(xì)胞生存率劑量效應(yīng)的細(xì)胞分組為:正常對(duì)照組、TDCPP染毒1μM、5μM、15μM、20μM、25μM、50μM、75μM組共8組，染毒6天;檢測(cè)TCEP暴露下PC12細(xì)胞生存率劑量效應(yīng)的細(xì)胞分組為:正常對(duì)照組、TCEP染毒15μM、2

5、0μM、40μM、80μM、150μM、200μM、400μM組共8組，染毒6天;為檢測(cè)染毒后生存率時(shí)間效應(yīng)，染毒濃度為50μM TDCPP，細(xì)胞分別持續(xù)染毒0-6天，各持續(xù)染毒時(shí)間段均設(shè)有正常對(duì)照組，且每組設(shè)6復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)中對(duì)各組細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察并拍照記錄。檢測(cè)TDCPP染毒后細(xì)胞凋亡率的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組為0μM、5μM、15μM、25μM、50μM TDCPP染毒組，染毒時(shí)間為持續(xù)染毒3天和持續(xù)染毒6天，每組設(shè)3復(fù)孔。
　　顯微鏡觀察結(jié)

6、果顯示在TDCPP或TCEP染毒作用下，PC12神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)均發(fā)生改變，神經(jīng)突觸長(zhǎng)度變短數(shù)量減少，神經(jīng)細(xì)胞間的神經(jīng)絲連接減少、形成的神經(jīng)結(jié)節(jié)也減少，神經(jīng)細(xì)胞變圓變小，生存數(shù)量減少;不同染毒濃度的TDCPP/TCEP暴露下，PC12細(xì)胞生存率均減少，存在劑量效應(yīng)關(guān)系;不同染毒持續(xù)時(shí)間的TDCPP暴露下，PC12細(xì)胞生存率亦減少，存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系;不同濃度和不同染毒時(shí)間TDCPP暴露下，PC12細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，且同樣存在時(shí)間和劑

7、量效應(yīng)。這些結(jié)果均提示了TDCPP/TCEP對(duì)PC12細(xì)胞具有神經(jīng)毒性，且表現(xiàn)在發(fā)育毒性和細(xì)胞毒性兩個(gè)方面。
　　二、TDCPP/TCEP導(dǎo)致PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的生物標(biāo)志物
　　實(shí)驗(yàn)用PC12細(xì)胞以1×105細(xì)胞密度接種至6孔培養(yǎng)板中，隔天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，培養(yǎng)液含終濃度為20μg/L的NGF以刺激分化PC12細(xì)胞。培養(yǎng)至細(xì)胞鋪率達(dá)70％后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒換液。細(xì)胞分組為正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、TDCPP5μM、15μM、25

8、μM、50μM組;或正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、TCEP40μM、80μM、150μM、200μM組，每組3個(gè)復(fù)孔，2-3天換一次液，持續(xù)染毒6天。
　　分別對(duì)各組PC12細(xì)胞進(jìn)行收集，提取蛋白后采用WB技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)蛋白。結(jié)果顯示OPFRs影響PC12細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白CaMK2、GAP43的翻譯水平，TDCPP使其表達(dá)量相比正常細(xì)胞降低約20％-40％，且與TDCPP染毒存在劑量效應(yīng)關(guān)系;TCEP使GAP43表達(dá)量相比正常細(xì)胞降低約50

9、％，而CAMK2的表達(dá)水平呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。另外，PC12細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白tubulin、NF-H的翻譯水平在TDCPP作用下最大降幅約為30％，且同樣與TDCPP染毒存在劑量效應(yīng)關(guān)系;而TCEP作用下骨架蛋白tubulin翻譯水平同樣降低約20％-30％，NF-H翻譯水平卻呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，最多相比正常組增加約1倍。所以，在OPFRs作用下神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白翻譯水平的改變，可引起神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育受損，損傷神經(jīng)細(xì)胞PC12的正常形態(tài)，阻礙其發(fā)揮

10、正常功能，從而引起PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性，而以上幾類與神經(jīng)相關(guān)目標(biāo)蛋白，可能成為其神經(jīng)毒性效應(yīng)主要的生物標(biāo)志物。
　　三、TDCPP導(dǎo)致PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的可能分子生物機(jī)制
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平的改變細(xì)胞分組為正常對(duì)照組、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM組，每組3個(gè)復(fù)孔，2-3天換一次液，分別持續(xù)染毒1-6天;WB檢測(cè)CaMK2、MAPK通路蛋白及其磷酸化水平的改變細(xì)胞分組為:①持續(xù)染毒4天

11、，組別為正常對(duì)照組、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM組，以探究其蛋白磷酸化水平改變與TDCPP染毒的劑量效應(yīng)關(guān)系;②以50μMTDCPP染毒，分別持續(xù)染毒1-6天，以探宄其蛋白磷酸化水平改變與TDCPP染毒的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。為確定CaMK2與MAPK通路之間關(guān)系實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組為正常對(duì)照組、正常對(duì)照+KN93處理組、25μM TDCPP染毒組、25μM TDCPP+KN93處理組、50μM TDCPP染毒組、50μM TDCPP

12、+KN93處理組。KN93抑制劑使用濃度為10μM，前處理時(shí)間為1小時(shí)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞連續(xù)染毒時(shí)間為6天。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在TDCPP的作用下，PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)受到破壞，隨著染毒劑量增加呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平增多的劑量效應(yīng)關(guān)系，且隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平同樣呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)。CaMK2和MAPK通路蛋白磷酸化水平增加，其中CaMK2的磷酸化呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng);JNK和p38蛋白磷酸化水平增多表現(xiàn)相似的

13、變化趨勢(shì)，存在明顯的劑量效應(yīng);Erk1/2蛋白磷酸化水平增多則存在明顯的時(shí)間效應(yīng)。另外TDCPP染毒的PC12細(xì)胞中，MAPK通路磷酸化水平增多可以被CaMK2磷酸化抑制劑部分抑制，提示了MAPK信號(hào)通路與CaMK2蛋白之間存在相互作用關(guān)系，暴露于TDCPP下的PC12細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路部分被直接激活，部分由CaMK2的磷酸化引起。由此，第二信使Ca2+、關(guān)鍵蛋白CaMK2和MAPK信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平的改變，可能成為典型有機(jī)磷

14、酸酯類阻燃劑TDCPP暴露所致PC12細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)的生物分子作用機(jī)制。
　　綜上，可得出如下結(jié)論:TDCPP/TCEP可引起PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性，調(diào)節(jié)蛋白CaMK2、GAP43和骨架蛋白tubulin、NF-H可能成為其重要的生物標(biāo)志物，而信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)其神經(jīng)毒性，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平增多、CaMK2磷酸化、MAPK信號(hào)通路激活可能成為TDCPP引起PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的生物分子機(jī)制。本課題實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果將豐富以TDCP