δEF1在成骨細(xì)胞分化以及乳腺癌細(xì)胞EMT中的功能研究.pdf

1、南開大學(xué)博士學(xué)位論文δEF1在成骨細(xì)胞分化以及乳腺癌細(xì)胞EMT中的功能研究姓名：楊爽申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：朱天慧20070501摘要結(jié)果顯示，rhBMP2誘導(dǎo)的ALP活性被顯著抑制在本底水平。除ALP活性外，還檢測了全長8EFl對另外2個成骨細(xì)胞分化標(biāo)志性基因I型膠原和Osterix的抑制作用。同樣用200ng／ml的rhBMP2處理△6FL細(xì)胞，分別經(jīng)0、3、12、24小時收取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行半定量R

2、TPCR分析。結(jié)果顯示rhBMP2誘導(dǎo)的I型膠原和Osterix在mRNA水平的表達(dá)明顯降低。上述實(shí)驗結(jié)果進(jìn)一步表明iEFl能夠有效地抑制rhBMP2誘導(dǎo)的小鼠前成肌細(xì)胞C2C12向成骨細(xì)胞方向分化。目前對于5EFl轉(zhuǎn)錄抑制功能的分子機(jī)制主要是認(rèn)為8EFl通過兩端鋅指結(jié)構(gòu)簇與被調(diào)控基因上游啟動子中CA(C／G)(C／G)TG序列結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。為了探討前文中8EFl對BMP2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的抑制功能是否也依賴于其鋅指結(jié)構(gòu)功能域。本文又構(gòu)

3、建了3種缺失突變型6EFl表達(dá)質(zhì)粒，分別為：pcDNA6B6NZF(只缺失N端鋅指結(jié)構(gòu)簇)、pcDNA6B6CZF(只缺失C端鋅指結(jié)構(gòu)簇)和pcDNA6B6M(缺失N和C端鋅指結(jié)構(gòu)簇)，并分析了分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上述3種8EFl缺失突變體的C2C12細(xì)胞對rhBMP2誘導(dǎo)的反應(yīng)；結(jié)果顯示，過表達(dá)這3種8EFl缺失突變體均能夠顯著抑制rhBMP2誘導(dǎo)的ALP活性以及I型膠原和Osterix轉(zhuǎn)錄水平的升高。因此，8EFl對rhBMP2誘導(dǎo)C2C1

4、2細(xì)胞成骨分化的抑制作用并不依賴于8EFl兩端的鋅指結(jié)構(gòu)簇。細(xì)胞的增殖與分化是成骨細(xì)胞形成過程中緊密關(guān)聯(lián)的兩個事件，本文利用CCK8方法證實(shí)全長6EFl過表達(dá)對C2C12細(xì)胞的增殖也有顯著影響。結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)無論是否存在rhBMP2誘導(dǎo)，△6FL細(xì)胞的增殖速度都明顯快于空載體對照組。上述結(jié)果表明8EFl能夠有效地促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖，而且該作用不依賴于BMP2。在初步闡明8EFl對成骨細(xì)胞增殖與分化具有調(diào)控作用的基礎(chǔ)上，本文又對與之相關(guān)

5、的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行了探討。鑒于經(jīng)典的BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由Smads介導(dǎo)，本文進(jìn)行了一系列免疫共沉淀實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)5EFl不能夠與Smadl、Smad4或Smad6形成免疫復(fù)合物。這一結(jié)果說明8EFl不能通過與Smads直接結(jié)合而參與BMP／Smad信號通路并介導(dǎo)對BMP2信號的抑制作用。為此，我們利用MereuryProfilingPathwaySystems對iEFl可能參與的其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)6EFl能夠特異性地調(diào)控AP