δEF1調(diào)控乳腺癌細胞增殖和骨轉移的功能研究.pdf

1、第一部分：δEF1在乳腺癌細胞增殖中的功能研究
　　 乳腺癌是女性最常見的多發(fā)惡性腫瘤之一，無限增殖是幾乎所有腫瘤細胞的特征之一，乳腺癌也毫不例外，乳腺癌細胞的異常增殖以及隨后發(fā)生的轉移過程所涉及的生物學過程及其原理尚不很清楚，這嚴重影響了乳腺癌的預防和治療進展。δEF1(δ-crystallin enhancer-binding factor1)隸屬于一類鋅指結構的轉錄因子超家族，具有廣泛的轉錄抑制功能。該轉錄抑制功能主要依靠

2、其兩端的鋅指結構簇與被調(diào)控基因的上游啟動子中E2-box的結合而實現(xiàn)。雖然已知δEF1是癌細胞增殖和分化的一個重要的調(diào)節(jié)因子，但是關于它在調(diào)控細胞周期進程中的潛在功能還不是很清楚。
　　 我們用CCK-8試劑盒和Brdu參入流式細胞儀檢測的方法研究δEF1在乳腺癌細胞周期中的作用。CCK-8實驗結果表明，在MDA-MB-231細胞中過表達δEF1蛋白，可以明顯促進細胞數(shù)目的增多；敲除掉內(nèi)源的δEF1，則反之。BrdU處理并用流式

3、細胞儀檢測，結果證實在MDA-MB-231細胞中，δE目的過表達可以非常明顯使細胞周期處于S期的細胞的數(shù)目增加；用RNA干擾技術敲除掉δEF1，則可以得到相反的效果，這就說明δEF1可以促進乳腺癌細胞G1-S期的轉換。
　　 在初步證實了δEF1可以促進乳腺癌細胞從G1向S期的轉化的情況下，我們進一步對其分子機制進行了研究：在MDA-MB-231細胞中過表達δEF1，無論在轉錄水平還是翻譯水平，均可看到CDK2和CDK4表達量的

4、增加，p21表達量得減少。如果敲除掉內(nèi)源性的δEF1，則CDK2和CDK4的表達量明顯減少，p21的表達量明顯被上調(diào)。
　　 這就證實在MDA-MB-231細胞中δEF1可以下調(diào)p21的表達，同時可以上調(diào)CDK2和CDK4的表達。為了進一步分析8EF1在轉錄水平是怎樣調(diào)控p21的表達，首先，我們構建了一系列不同截短長度的人p21啟動子的熒光素酶報告載體，并用網(wǎng)上的在線工具TRANSFAC和TESS，對人p21啟動子進行了分析，結

5、果發(fā)現(xiàn)在人p21啟動子-545/-540處存在一個E2-box(CAGGTG)。熒光素酶實驗和CHIP實驗均證實δEF1通過結合到p21啟動子的E2-box上，從而抑制p21的轉錄。
　　 我們又在雌激素受體ER陰性的MDA-MB-231，ER陽性的MCF-7、ZR-75-1、T47-D四種人乳腺癌細胞中用實時定量PCR和western blot方法檢測到δEF1和p21表達呈明顯的負相關。進一步在22例人乳腺癌組織臨床標本中，

6、實時定量PCR也檢測δEF1和p21表達呈負相關。這都支持δEF1通過調(diào)控p21的表達從而調(diào)控乳腺癌細胞周期進程。
　　 綜上所述，在乳腺癌細胞中，δEF1通過下調(diào)p21的表達，同時上調(diào)CDK2和CDK4的表達雙重機制促進MDA-MB-231細胞的增殖。δEF1對細胞周期調(diào)控方面的研究，必將為我們?nèi)绾畏乐稳橄侔┨峁┮恍┬碌乃悸贰?br>　　 第二部分：δEF1在乳腺癌細胞骨轉移中的功能研究
　　 在乳腺癌轉移的很多階段

7、中，上皮細胞向間充質細胞的轉化EMT是癌細胞擴散機制的基礎，δEF1是含有鋅指結構域的轉錄因子超家族的成員，在乳腺癌EMT和骨重建中起著重要的作用。
　　 我們發(fā)現(xiàn)δEF1在具有高遷移傾向的MDA-MB-231細胞中表達量較高，在具有低遷移傾向的MCF-7、T47-D和ZR-75-1細胞中表達量較低，并且在MDA-MB-231中過表達8EF1可以促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲，而敲除掉內(nèi)源性的δE目的表達，則乳腺癌細胞的遷移和侵襲會

8、受到抑制。
　　 骨是乳腺癌發(fā)生轉移的主要靶器官之一，乳腺癌骨轉移的發(fā)生往往伴隨著成骨細胞和破骨細胞功能的紊亂。因此我們研究了MDA-MB-231細胞中δEF1表達的變化對乳腺癌誘導的破骨細胞成熟，成骨細胞成熟和鈣沉積的影響。結果表明，過表達δE目的MDA-MB-231細胞條件培養(yǎng)基不僅具有較高的誘導RAW264.7細胞TRACP活性的能力，進而促進破骨細胞的分化；而且可以抑制BMP-2誘導的C2C12細胞ALP活性的升高，以及

9、抑制BMP-2誘導的C2C12細胞中osterix和骨鈣素的表達增加，從而抑制成骨細胞的成熟；還可以減少MC3T3-E1細胞被茜素紅染色的細胞數(shù)從而抑制成骨細胞的鈣沉積。這就證實用過表達δE目的MDA-MB-231中收集的條件培養(yǎng)基可以明顯的誘導破骨細胞的成熟，并且同時抑制成骨細胞的分化和礦化：另一方面，敲除δEF1表達的MDA-MB-231細胞的條件培養(yǎng)基則表現(xiàn)出相反的作用。
　　 為了探索δEF1在乳腺癌骨轉移中的具體分子機

10、制，我們檢測發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231細胞中，δEF1從轉錄和翻譯兩個水平都可以顯著的上調(diào)基質金屬蛋白酶-1 MMP-1的表達。用轉錄因子數(shù)據(jù)庫TESS分析MMP-1的啟動子，發(fā)現(xiàn)在-70/-60的位置存在了一個AP-1位點(CATGAGTCAG)，熒光素酶實驗結果顯示，TPA可以上調(diào)MMP-1啟動子的活性，而姜黃素(Curcumin)可以抑制MMP-1啟動子的活性。而TPA，Curcumin和δEF1對人MMP-1啟動子突變后的AP-

11、1元件完全沒有任何作用響應。ChIP實驗證實過表達δEF1可以明顯的使內(nèi)源性的MMP-1啟動子募集到更多的AP-1成員c-Jun/c-Fos。熒光素酶實驗和CHIP實驗結果都證實δEF1通過MMP-1啟動子上的AP-1應答元件激活其啟動子的活性。
　　 AP-1的組成元件已被證明是MAPK信號通路的下游分子，Western blot實驗證實δEF1可以顯著激活MDA-MB-231細胞中JNK信號通路，并且熒光素酶實驗表明特異性J