海島棉顯性無腺體基因Gl2e的圖位克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、除了棉纖維，棉籽是棉花加工中的主要副產(chǎn)品，富含大量的蛋白質(zhì)和脂肪。然而，棉酚及其衍生物沉積在腺體中使棉籽對(duì)人和單胃動(dòng)物等非反芻動(dòng)物有毒性，棉酚含量僅0.15％～0.20％就可產(chǎn)生很嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象，致使?fàn)I養(yǎng)豐富的棉籽不能被直接食用。棉酚是一種貯存于棉花色素腺體中的倍半萜烯類化合物，在根尖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)棉酚主要在根部合成，然后運(yùn)輸?shù)较袤w內(nèi)積累。棉酚也是植株自身防御病蟲危害的重要組成部分，若植株部位缺少棉酚會(huì)導(dǎo)致棉花病蟲的危害而影響產(chǎn)量。遺傳

2、分析表明Gl2e基因是控制腺體有無的顯性基因，為Gl2和Gl3的復(fù)等位基因，并對(duì)Gl2和Gl3顯性上位，在Gl2e基因的存在下能夠消除棉花植株部分和種子的所有腺體，并導(dǎo)致低棉酚含量。
　　在本研究中構(gòu)建了[（TM-1×海1），(TM-1×N1)，(TM-1×N7)]三個(gè)海陸F2群體，共2197個(gè)單株，利用361對(duì)SSR引物將Gl2e定位在分子標(biāo)記w5383和w7954之間。Gl2e與w5383和w7954的距離分別為0.5cM和0

3、.6cM。根據(jù)遺傳定位結(jié)果，對(duì)候選區(qū)段內(nèi)7個(gè)候選基因的進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示ORF2在有腺體材料和無腺體葉片之間存在顯著的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異。該基因編碼一個(gè)全長1428bp的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，無內(nèi)含子。在有腺體材料和無腺體材料之間存在3個(gè)SNPs，導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的差異。根據(jù)此基因的SNPs設(shè)計(jì)引物重新進(jìn)行遺傳定位，引物與表型之間緊密連鎖，并無分離單株，確定該基因就是控制腺體形成的關(guān)鍵基因。在單節(jié)顯性腺體材料中，gl2和gl3基因中均發(fā)生了

4、堿基插入，導(dǎo)致提前終止。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virusinduced gene silencing，VIGS)技術(shù)驗(yàn)證Gl2e的功能。Gl2e基因沉默后，表達(dá)量下降、腺體形成受到明顯抑制，新生葉片和莖桿腺體逐漸減少，葉片中半棉酚和棉酚含量顯著下降。在有腺體材料TM-1中Gl2e基因被沉默和未沉默的葉片轉(zhuǎn)錄組比較分析結(jié)果顯示，4293個(gè)基因在正常葉片和Gl2e干擾葉片中差異表達(dá)，其中2276個(gè)基因在干擾后上調(diào)表達(dá)，1306個(gè)基因下調(diào)表

5、達(dá)。上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在光反應(yīng)、細(xì)胞壁降解、蛋白質(zhì)合成;下調(diào)表達(dá)基因顯著富集在次生代謝、茉莉酸信號(hào)和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。棉酚生物合成途徑中的重要基因如TPSs家族在干擾葉片中顯著下調(diào)表達(dá)，表明腺體與棉酚生物合成之間存在密切分子聯(lián)系。
　　色素腺體是棉酚及其衍生物的主要存儲(chǔ)器官，腺體的有無、密度與棉酚含量密切相關(guān)。本研究通過圖位克隆成功獲得了一個(gè)控制腺體的關(guān)鍵基因Gl2e，為棉花等多倍體材料的圖位克隆提供寶貴經(jīng)驗(yàn)。也將幫助我們