海島棉VWR基因的克隆和抗黃萎病功能研究.pdf

1、我國棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳維管束真菌病害，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。種植抗黃萎病的棉花品種是最經(jīng)濟(jì)有效的防治方法。作為世界兩大主要栽培棉種的陸地棉和海島棉在農(nóng)藝性狀上具有顯著的差別，陸地棉表現(xiàn)產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)但缺乏免疫或高抗黃萎病的抗源材料，海島棉具有對黃萎病免疫或高抗且品質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn)。將海島棉黃萎病抗性轉(zhuǎn)育到陸地棉或利用基因工程手段將海島棉的抗病基因轉(zhuǎn)化到陸地棉中來改良陸地棉的抗病性是現(xiàn)代棉花抗病育種的重要策略之一。因此研究分離

2、鑒定海島棉抗黃萎病相關(guān)基因并研究其功能對于抗黃萎病分子育種具有重要意義。
　　本研究通過篩選黃萎病菌脅迫下的海島棉全長cDNA文庫和陸地棉SSH文庫，獲得2個與黃萎病菌脅迫相關(guān)的基因，Blast比對發(fā)現(xiàn)該基因目前沒有任何解讀信息，我們將海島棉中該基因命名為GbVWR1和GbV WR2。為了明確GbVWR基因在棉花抗黃萎病中的作用，本研究分別對GbVWR1和GbVWR2基因進(jìn)行克隆，組織表達(dá)特異性分析、黃萎病菌脅迫及激素誘導(dǎo)下的基因

3、表達(dá)，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)研究其抗黃萎病功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.克隆獲得海島棉GbVWR1和GbVWR2全長序列，對應(yīng)的ORF分別為198bp和720bp;分別編碼65個和239個氨基酸殘基的蛋白;GbVWR1含有一個信號肽和一個跨膜域，而GbVWR2無信號肽和跨膜域。
　　2.生物信息學(xué)分析啟動子相關(guān)作用元件發(fā)現(xiàn)，GbVWR1的啟動子含有響應(yīng)真菌誘導(dǎo)、赤霉素和類黃酮生物合成等相關(guān)的順式作用元件;

4、GbVWR2的啟動子含有響應(yīng)真菌誘導(dǎo)、茉莉酸、赤霉素、水楊酸、和植物逆境防御反應(yīng)的順式作用元件。
　　3.利用qRT-PCR分析基因的組織表達(dá)特性以及受黃萎病菌和激素處理后基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示GbVWR1和GbVWR2在抗病海島棉Pima90-53、耐病陸地棉農(nóng)大601和感病陸地棉CCRI8的根、莖和葉中均有表達(dá)，并且兩個基因在根中的表達(dá)量最高。GbVWR1和GbVWR2均受黃萎病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，GbVWR1受茉莉酸、水楊酸、乙

5、烯和赤霉素上調(diào)表達(dá);而GbVWR2受茉莉酸、水楊酸和乙烯下調(diào)表達(dá)，受赤霉素上調(diào)表達(dá)。
　　4.構(gòu)建了融合表達(dá)載體pCamE-VWR1∷GFP和pCamE-VWR2∷GFP，基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞。結(jié)果表明pCamE-VWR1∷GFP融合蛋白在細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜、液泡膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位均有明顯的綠色熒光信號，推測GbVWR1蛋白定在膜系統(tǒng)上發(fā)揮功能，pCamE-VWR2∷GFP融合蛋白定位在細(xì)胞核。構(gòu)建了原核表達(dá)載體pE

6、T-VWR1、pET-VWR2，經(jīng)終濃度為1.0 mM的IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE蛋白電泳顯示重組質(zhì)粒分別表達(dá)分子量為25kDa和35kDa左右的特異蛋白條帶。
　　5.通過VIGS技術(shù)分別抑制海島棉內(nèi)源GbVWR1和GbVWR2基因的表達(dá)，黃萎病菌處理后20天左右，沉默植株比對照表現(xiàn)更為感病，病指增高。說明GbVWR1和Gb VWR2都參與棉花抗黃萎病反應(yīng)。
　　綜上結(jié)果，本研究克隆了海島棉兩個功能未知新基因GbVW