ALV-J體內(nèi)感染誘導(dǎo)NLRP3炎癥體和MDA5介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng).pdf

1、J亞群禽白血病病毒（Avian leucosis virus subgroup J，ALV-J）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，可以引起雞免疫抑制和多發(fā)性腫瘤。由于ALV-J變異速度快，機體較難獲得有效的免疫保護，目前尚無防治該病的有效疫苗。天然免疫是機體抗感染的首要防線，病毒入侵后會被天然免疫系統(tǒng)識別，進而引發(fā)相關(guān)免疫通路的活化和抗病毒反應(yīng)。天然免疫識別受體中Nod樣受體(Nod-like receptors,NLRs)、RIG-I樣受體(RIG-I

2、-like receptors,RLRs)在抗RNA病毒中發(fā)揮著重要作用。本研究對ALV-J感染早期時黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)家族成員NLRP3炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控機制進行探討，為揭示ALV-J致病機制和宿主抗病毒免疫機制提供參考。
　　首先，將本實驗室分離的ALV-J

3、臨床株（命名為AJV-HF211）進行DF-1細胞增殖和鑒定，再將70只1日齡SPF雞隨機分為兩組，攻毒組42只，對照組28只，經(jīng)頸部皮下接種ALV-HF211細胞毒，0.2mL/只，2x104TCID50/mL，對照組接種細胞培養(yǎng)液，0.2mL/只。在感染不同天數(shù)后（days post infection，dpi）剖檢觀察病變，取肝臟制備石蠟切片。結(jié)果表明，攻毒組雞胸腺出血、萎縮，肝臟和脾臟有出血點，膽囊萎縮、膽汁量少且呈淡黃色。此外

4、，AJV-HF211毒株感染組織中炎性細胞增殖明顯。
　　其次，通過RT-PCR方法檢測雞肝組織中病毒的核酸片段并設(shè)計擴增MDA5、NLRP3及其下游caspase-1及細胞因子IL-1β、IL-18、IFN-β和IFN-γ基因片段的特異性引物，進一步建立SYBR GreenⅠ實時熒光相對定量 RT-PCR檢測方法（RT-qPCR），分別檢測感染組和對照組雞肝組織內(nèi)的MDA5、NLRP3及其下游接頭分子和細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。RT-

5、PCR檢測ALV-J結(jié)果表明，在感染9dpi，首次檢測到ALV-J特異性基因片段，且9-17dpi期間均能檢測到該片段的存在。RT-qPCR結(jié)果表明，與未攻毒的對照組相比，AJV-HF211毒株感染可誘導(dǎo)雞體內(nèi) MDA5、NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β和IL-18基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度增加，而IFN-β和IFN-γ的表達無明顯變化。其中，NLRP3/caspase-1在1-3 dpi表達變化不明顯，而在5-7 dp

6、i時明顯升高（p<0.01），在9dpi開始下降；IL-1β和IL-18在1-5dpi無明顯變化，在7-17dpi表達量明顯升高（p<0.05）。這表明炎癥初期NLRP3轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，且變化趨勢和caspase-1、IL-1β和IL-18基因基本一致。MDA5在1-5dpi時變化不明顯，但在7-17dpi保持較高轉(zhuǎn)錄水平趨勢。上述結(jié)果提示，NLRP3/caspase-1炎癥通路和MDA5受體在 AJV-HF211感染早期可能發(fā)揮重要

7、作用，而AJV-HF211毒株可能通過負向調(diào)控干擾素誘生機制逃逸免疫應(yīng)答。
　　最后，將雞飼養(yǎng)至240日齡，觀察腫瘤發(fā)生情況，并取肝臟組織制作石蠟切片， HE染色觀察細胞狀態(tài)。結(jié)果表明，AJV-HF211毒株感染部分雞精神萎靡，食欲不振，羽毛蓬亂，伴有腹瀉消瘦，貧血等癥狀；剖檢觀察到肝臟、心臟、卵巢均有實質(zhì)性增生物出現(xiàn)。石蠟切片HE染色結(jié)果表明，攻毒組肝臟有明顯的腫瘤灶，表現(xiàn)為髓細胞瘤和血管瘤。此外，還可見淋巴樣細胞浸潤，肝細胞索